METHODE D'ISOLE:ENT DES NOYAUX CELLULAIRES

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À) Introduction

Le problème de l'isolement des noy.ux à préoccupé les biologistes bien avant que le principe du frictionnement cellulaire par centrifugation n'ait été donné par CLAUDE,. Les diverses techniques établies n'ont pu jusqu'ici concilier les trois aSpeoLs suivants :

- pureté de la préparation, - maintien de l'intégrité morpholosique et chimique, - obtention quantitative de cette structure,

Les techniques de :ARSHAK (60), B£&HRENS (6), DOUNCE (29, 30) conduisent à l'isolement, avec un rendement très faible, de noyaux purs mais ayant subi de profondes :ltérations, HOG£BOOM (42) isole la presque totalité des noyaux d'un homogénéisat de foie mois au prix d'une longue purification entraînant l'altération inévitable de cette structure. Nous &vons cherché à résoudre ce problème par une voie différente,

B) Principe

Dans un milieu de dispersion isotonique, donc de densité inférieure à celle de toutes les structures, l'isolement des noyaux ne peut être accompli que par li méthode des centrifugations fractionnées, Or, le principe même de cette méthode, c'est-à-dire l'utilisation des différences de vitesses de sédimentation entre particules, ne permet p:s, théoriquement, une sép-ration totale puisque toutes les prticules se déplacent dans le même sens, Ce n'est qu'en multipliint les centrifugations que l'on peut espérer parvenir à un isolement satisfaisant,

Par contre l'utilisation des différences de densité existant entre les particules permet cette séparation totale puisque seules les particules dont l: densité est supérieure à celle du milieu sédimentent au cours d'une centrifugation, les autres se déplaçant en sens inverse, Une seule centrifugation suffit donc à séparer les particules les plus denses si l'on peut utiliser un milieu de densité suffisamment grande,

Dans un honogénéisat de tissu, la densité des noyaux est notablement supérieure à celle des autres structures (mitochondries, microsomes) et à celle des cellules intactes notamment conjonctives, qu'il importe d'écarter. IL nous fallait trouver un milieu de dispersion de densité suffisamment élevée,

n'altérant pas les structures cellulaires, Les solutions très concentrées de saccharose répondent exactement à ce but car entre 0,88 et 2,5 M nous n'avons pas observé d'altération morphologique visible au contraste de phase soit des mitochondries soit des noyaux, Nous ne donnerons pas ici le détail de nos recherches mis seulement le résultat auquel nous avons abouti.

C) Mode Opératoire

Toutes les manipulitions étant effectuées à 0°, le tissu est homogénéisé dans 20 volumes de saccharose 2,2 M (d = 1,28) et l'homogénéisat est centrifugé 1 h à 40,000 g. La totalité des noyaux se rassemble en un culot ayant l'aspect d'une gelée incolore ; les débris de tissu conjonctif, les cellules éventuellement présentes et les mitochondries se rassemblent en surface.

Remis envsuspension dans le saccharose 2,2 M les noyaux se dispersent aisément rendant leur numération facile, Leur conservation à 0° est excellente : au bout d'un mois, ils ne présentent encore aucune altération notable,

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