ON 10 UN PO APT

Titrage de l’alexine. — On fait une dilution au 1/100° du sérum de cobaye avec de l’eau salée physiologique à 8,9 pour 1000. On met dans des tubes à essai o cc. 1, O CC. 2, o ce. 3, etc... 1 centimètre cube de cette alexine diluée, ou de plus fortes doses si celles-ci sont insuflisantes pour obtenir l’hémolyse (comme le fait se présente quand l’alexine est vieille). On complète tous les tubes au même volume (jusqu’à 2 centimètres cubes par exemple) avec de l’eau salée. On ajoute le sérum hémolytique inactivé (toujours en excès), 1 goutte de sang, et l’on complète de nouveau chaque tube jusqu’à 3 cen. timètres cubes avec de l’eau salée. On porte une heure à l'étuve à 37°.

La dose d'alexine restée libre (non fixée) est indiquée par le premier tube de la série où l’onconstate l'hémolyse et l’on prendra une dose double de celle-ci comme dose minima dans l'expérience de fixation.

Afin de ne pas employer l’alexine sous un trop grand volume qui gênerait l’opération, on en fera une dilution telle que un dixième de centimètre cube contienne la dose minima (pour l'alexine fraîche de cobaye, la dilu-

tion à réaliser varie en général du sixième au dixième.)

IV.— SÉRUM DU MALADE. — Le sang du malade sera obtenu par ponction veineuse ou par ventouses scarifiées (celles-ci pouvant se trouver, avec avantage, munies d’un réservoir sphérique pour recueillir le sang et d’une tubulure pour faire le vide) (1). De toute façon,

(1) Mézre. Soc. de Biol., 7 janv. 1911.

ee ;

=NDOSiEe

il faudra auparavant faire bouillir l'aiguille et la seringue ou les ventouses dans l’eau salée physiologique à 8,5 pour 1000 et nettoyer la peau du malade au savon, à l’éther et à l'alcool, puis à l’eau salée physiologique.

Afin d'obtenir les 5 ou 6 centimètres cubes de sérum nécessaires à la recherche des anticorps, on prélèvera de 15 à 20 centimètres cubes de sang.

Le sérum décanté au bout de 24 heures au moyen d’une pipette stérile sera chauffé 50 minutes à 56° pour détruire l’alexine. On pourra le conserver ensuite très

longtemps à la glacière sans altérations.

V. — AnrTiGÈnes. — Les divers antigènes tuberculeux (tuberculines, extraits bacillaires, bacilles) et leur valeur respective ont été étudiés surtout par MM. Calmette et Massol (1). Ces auteurs, nous l'avons vu plus haut, ont divisé les sérums contenant les anticorps tuberculeux en deux groupes: 1° Les uns uniquement sensibilisants, qui fixent leurs anticorps indistinctement sur l’antigène des bacilles soluble dans l'eau et sur l’antigène qui reste adhérent aux bacilles épuisés par l’eau distillée; 2° les autres à la fois sensibilisants et inhibants qui ne fixent leurs anticorps que sur l’antigène insoluble dans l’eau, alors que leur inhibitrice peut être décelée au moyen des deux antigènes,

MM. Calmette et Massol ont établi cette classification

(1) À. Cacmerre et L. Massor. Sur la fonction antigène des tuberculines. C. R. Acad. des Sciences, 14 août 1911, p. 420 et Soc, de Biol., DL XXT pl 341528 oct 1ORE

en préparant deux antigènes à partir des bacilles tuberculeux : l’un (extrait bacillaire 1) préparé par l’eau distillée, capable de fixer les anticorps contenus dans les sérums du premier groupe (sérums uniquement sensibilisants) ; l'autre (extrait bacillaire IT) préparé par l’eau peptonée à 10 pour 100, capable de fixer les anticorps contenus dans les sérums du premier groupe et aussi

du second groupe (sérums sensibilisants et inhibants).

Préparation de l'extrait bacillaire I. — Des cultures de tuberculose bovine en bouillon glycériné sont stérilisées à 100° et filtrées. Les bacilles recueillis sur le filtre sont lavés abondamment à l'eau froide. On les réunit ensuite dans un ballon avec de l’eau distillée. On porte à 100° pendant une heure, on laisse 2/4 heures en contact et on filtre. On répète la même opération jusqu’à ce que les bacilles d’un litre de culture aient été épuisés par six litres d'eau environ. Tous les filtrats réunis sont concentrés dans le vide à 60° et réduits à 10 centimètres cubes par litre de culture initiale. On enlève ainsi aux bacilles o gr. 2 à

o gr. 4 d'extrait sec.

Préparation de l'extrait bacillaire II. — On jaisse macérer pendant 48 heures au bain-marie à 65°, 5 grammes de bacilles secs, par exemple, dans 100 centimètres cubes d'une solution de peptone de Witte à 10 pour 100 dans l’eau distillée, et on filtre

ensuite.

En étudiant la tuberculine ancienne de Koch, MM. Calmette et Massol avaient vu, en effet, que, seule, la peptone qui entre dans la composition de cette tuberculine, avait la propriété d'enlever aux bacilles

l’antigène insoluble dans l’eau.

LeTuzze. 14

La tuberculine brute (ancienne de Koch) possède les deux antigènes ; mais elle contient des substances complexes et inactives qui sont nuisibles à la réaction de fixation. L’extrait bacillaire Il peptoné lui est donc pré- , .férable: . |

La tuberculine brute perd beaucoup de sa valeur comme antigène lorsqu'on la précipite par l’alcoo! sous prétexte de la purifier. En cet état, elle ne fixe que rarement les anticorps contenus dans les sérums du premier groupe et elle ne fournit jamais la réaction de déviation avec les anticorps contenus dans les sérums du second groupe.

Les tuberculines obtenues par simple évaporation des cultures après séparation des bacilles, n’ont aucune valeur comme antigène.

: Après l'extrait bacillaire IT peptoné, les bacilles secs tués à 100° et émulsionnés à 1 pour 1 000 dans l’eau physiologique, représentent le meilleur antigène puisqu'ils permettent dans tous les cas, comme le fait l'extrait bacillaire IT, de fixer les anticorps que renferment les sérums de tuberculeux, même lorsque ces sérums contiennent l'inhibitrice. Cependant le louche que déterminent les bacilles dans les tubes à réaction est, pour l'interprétation des résultats, un inconvénient que ne présente pas l'extrait bacillaire I].

En pratique, il est: conseillé de toujours vérifier comparativement avec des bacilles secs la valeur d’un

antigène.

Détermination du pouvoir antigène des diverses tubercu-

TN

lines. — Voici la technique de MM. Calmette et Massol (1), qui peut s'appliquer à tous les antigènes:

« La mesure de la valeur antigène d'une tuberculine peut s'effectuer de deux manières :

«1° En variant la dosed’antigène et laissant toutes leë autres conditions fixes:

« 2° En prenant une dose fixe d’antigène, des doses variables d’alexine et laissant toutes les autres conditions constantes (2). »

« Dans l’un et l’autre cas, on doit s'assurer que le sérum sensibilisant est en léger excès sur l’antigène : on peut alors calculer la quantité d’alexine que fixe un volume déterminé d’antigène.

M£ÉTHopE I. — « Prenons par exemple une série de dix tubes dans chacun desquels nous introduirons la même dose de sérum sensibilisateur (à anticorps) et des doses variables (telles que o cc. 1, o ec. 2, o cc. 3... 1 centimètre cube) d'une dilution de la tuberculine dont il s’agit de déterminer le pouvoir antigène, Dans chaque tube, nous ajoutons ensuite la même dose d’alexine de cobaye, par exemple o cc. 05, soit 10 doses minima, si o cc. 00 de cette alexine représente la dose minima capable de provoquer l’hémolyse en présence d’une dose fixe du sérum hémolytique dont on doit faire

usage. On complète partout à 2 centimètres cubes avec

(1) A. Cazmerre et L. Massoc. Soc, de Biol., t. LXXIT, p. 15, 6 janv. (2) Cazmerre et MassoL. C.R. Soc. de Biol., 13 nov. 1909.

H°O physiologique et on porte à l’étuve à 37° pendant 1 heure. Au bout de ce temps, on ajoute à chaque tube la même dose d’émulsion de globules lavés de mouton

ar exemple, eto cc. 1 d’un sérum hémolytique cheval anti-mouton (dont o cc. 005 et la dose minima hémolytique en présence d’un excès d’alexine). On porte de nouveau à l’étuve à 37° et on lit les résultats après 30 minutes d’abord, puis après dix-huit heures de séjour à la température du laboratoire.

« Si l’on constate qu’il n’y a pas d'hémolyse dans les tubes qui contiennent o cc. 3 et plus de la dilution de tuberculine, tandis que l’hémolyse est totale dans ceux qui n’en renferment que o cc. 1 et o cc. 2, on en conclut qu'à la dose de occ.3, la dilution d’antigène dont il s’agit fixe o cc. 05 d’alexine, soit 10 doses d'une alexine dont occ. 005 représente la dose minima capable de provoquer l’'hémolyse en présence d’un excès de sérum

hémolytique inactivé ».

MÉTHODE II. — « Pour déterminer avec plus de précision la valeur de notre antigène, nous employons une dose unique de ce dernier, o cc. 25 par exemple, déterminée par l'expérience précédente, et des doses variables d’alexine (0 ce. or, o cc. 02, o cc. 03..., o cc. 06), en laissant toutes les autres conditions constantes. Des tubes témoins contiennent séparément l’antigène seul et la sensibilisatrice seule avec les mêmes doses d’alexine. Cette expérience détermine aussi exactement que l’on veut le nombre (N) de doses minima d’alexine

que peut fixer le volume d’antigène employé (V). Pour

comparer les divers antigènes, il suffit d'établir pour

chacun d’eux les rapports v Un antigène dont o ec o1

dévie ro doses d’alexine, a pour valeur = 1 000.

0,01 1 centimètre cube de cet antigène est capable de dévier 1000 unités d’alexine.

Un autre antigène dont o ce. o2 fixe 9 doses d’alexine

a pour valeur —Ÿ— 450. Ce dernier est 2,22 fois plus

0,02 faible que le précédent.

La valeur d'un antigène déterminée en présence d’un sérum connu et exprimée en unités d’alexine fixée, représente un nombre qui ne varie pas, pourvu que le système hémolytique (hématies lavées et hémolysine) reste constant, ce qui est d’ailleurs facile à obtenir ».

VI. — DESCRIPTION DE LA RÉACTION DE FIXATION. — Nous donnerons également la technique de MM. Calmette et Massol (r), qui est générale et permet de titrer les anticorps contenus soit dans les sérums « antituberculeux » dont on se propose de faire usage, soit dans le sérum des malades au cours de la tuberculose, ou d’un traitement tuberculinique. On peut, grâce à cette technique, déceler les anticorps dans les deux groupes de sérums (sérums à sensibilisatrices, sérums à sensibilisatrices et inhibitrices) à condition de se servir comme

antigène d’une émulsion de bacilles tuberculeux sees

(2) A. CazmerTe et L. Massoz. Soc, de Biol., 6 janv. 1912, p. 16.

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tués par la chaleur, ou d’extrait bacillaire IT (peptoné) dont nous avons indiqué la préparation.

Lorsqu'on a préparé et titré les différents éléments nécessaires à la réaction de fixation, la recherche des anticorps et leur détermination quantitative peut être calquée sur celle des antigènes. Pour les sérums dits «antituberculeux » riches en anticorps, la mesure quantitative, pour être suffisamment rapide et précise, doit être effectuée suivant les règles établies plus haut dans les méthodes I et IT pour les antigènes.

Pour les sérums de malades tuberculeux qui sont toujours beaucoup plus pauvres en anticorps, la méthode II peut suffire à condition que les derniers tubes contenant les plus grandes quantités d'alexine soient hémolysés.

L'expérience comporte toujours trois séries de tubes : |

1° Antigène + sérum à étudier (5 tubes au moins);

2° Antigène seul (3 tubes);

3° Sérum seul (3 tubes).

On met dans tous lestubes des première etdeuxième séries la même dose d’antigène qu’on a déterminée précédemment, et, dans tous les tubes des première et troisième séries o ce. b de sérum à étudier. :

Puis, chacune des séries reçoit des doses d'alexine allant en croissant depuis la dose minima (dose double de celle qui a été précisée auparavant dans le titrage de l’alexine), par exemple o ce. or, o ec. 02, ...0 ce. 05. On complète chaque tube à 2 centimètres cubes avec de

l'eau salée physiologique à 8,5 pour 1 000 en ayant soin

de faire tourner le tube pour entrainer l’alexine qui aurait pu adhérer aux parois. Le tout est mis à l’étuve à 37° pendant une heure. Puis, on ajoute dans chaque tube une goutte de globules de mouton lavés et préparés comme nous l'avons indiqué, et o cc. 1 d’un sérum hémolytique anti-mouton inactivé (dont o ce. 005 est la dose minima hémolytique en présence d’un excès d’alexine). On complète ensuite chaque tube à 3 centimètres cubes avec de l’eau salée en lavant les parois. On porte de nouveau à l’étuve à 37° et on note les résultats au bout d’une demi-heure, puis après 18 heures à la température du laboratoire.

L’alexine est déviée dans les tubes où l’on ne constate pas d'hémolyse. La réaction est positive (existence d'anticorps) si l’alexine déviée par le mélange antigène —+ sérum (tubes série 1) est supérieure à la somme des volumes d'alexine déviée par l’antigène et l'anticorps séparément (tubes séries IT et IID).

Définition de l'unité d'anticorps. — Si le volume V de

sérum dévie N doses minima d’alexine, le rapport y

représente le nombre de doses minima d’alexine que peut dévier 1 centimètre cube de sérum. Il en résulte que l'unité de sensibilisatrices ou d’anticorps, comme celle d’antigène, peut être représentée par la quantité d'anticorps capable de dévier une dose minima d’alexine

(Calmette et Massol).