CHAPITRE II

TECHNIQUE DE LA RÉACTION DE FIXA- TION POUR LA RECHERCHE DES ANTI- CORPS DANS LES SÉRUMS DE TUBER- CULEUX. |

Nous indiquerons la facon de préparer et de titrer les divers éléments nécessaires pour exécuter la réaction de fixation: globules rouges, sérum hémolytique, alexine, antigènes et sérum du malade. Nous expose-

rons ensuite le dispositif de l'expérience.

I. — GLOBULES ROUGES. — On emploie généralement les globules de mouton qu’on peut se procurer facilement. Le sang est recueilli directement dans un flacon stérilisé rempli au dixième de perles de verre; on l’agite ensuite jusqu'à ce que la fibrine soit séparée et que le sang surnageant soit absolument liquide. Ce sang défibriné est alors enlevé avec une petite pipette à boule et disposé dans un tube de centrifuge afin de laver les globules pour les débarrasser de leur sérum: on met environ 1/4 de sang en ayant soin de marquer le niveau, et l’on ajoute 3/4 d'eau salée physiologique stérilisée à 8,5 de chlorure de sodium par litre. Les globules sont

séparés par centrifugation, et l'on décante le liquide surnageant en ne laissant au fond du tube que le culot de globules. Cette opération est recommencée trois fois. Après le troisième lavage et la décantation, on ajoute de l'eau salée physiologique jusqu’au trait qui indique le niveau primitif du sang défibriné, afin de ramener la suspension de globules dans l’eau physiologique au même volume que le sang correspondant.

Puis, on dilue les globules de moitié avec de l’eau salée physiologique.

On emploiera pour la déviation du complément une goutte de cette dilution, soit o ec. 05, donc o ec. 025 de globules (quantité qui paraît être la plus favorable pour un volume de 3 centimètres cubes sous lequel sera faite l'hémolyse). |

Les globules peuvent se conserver 3 semaines et davantage à la glacière dans des tubes stérilisés bouchés au coton. Un autre procédé de conservation consisterait (d’après P.F. Armand-Delille) à les additionner, aussitôt après le lavage, de formol pur du commerce (à 4o volumes) dans la proportion de 1 pour 500.

IT. — SÉRUM HÉMOLYTIQUE. — Pour obtenir un sérum

hémolytique (sensibilisatrice) spécifique vis-à-vis des:

globules rouges qui vont servir à l'expérience, on inocule aseptiquement, sous la peau d’un lapin, r centimètre cube de ces globules après les avoir lavés comme nous l’avons indiqué. Cette injection est recommencée tous les trois jours à trois reprises différentes. Cinq

jours après la dernière injection, le sérum du lapin

oo

contient des hémolysines anti-mouton. Il est alors saigné. Lorsque le sang est coagulé, on décante le sérum; celui-ci est réparti dans de petits flacons que l’on fait chauffer à 58° trois jours de suite pendant une demiheure pour détruire l’alexine et les germes qui pour-

raient être une cause d’altération.

Titrage du sérum hémolytique. — On le dilue au t /100* dans l’eau salée physiologique. On met dans des tubes à essai o cc. 1, 0 cc. 2, etc... jusqu’à 1 centimètre cube ou plus si c’est nécessaire. On complète tous les tubes au même volume (1 centimètre cube par exemple) avec de l’eau salée physiologique. On ajoute 1/10° de centimètre cube d’alexine fraîche de cobaye, 1 goutte de globules, et l’on complète tous Les tubes à 3 centimètres cubes avec de l’eau salée en ayant soin de faire tourner le tube entre les doigts afin de bien en laver les parois. Exfin, on place à l’étuve à 37° pendant une heure.

Si l’hémolyse commence dans le tube contenant o cc. 5 de sérum hémolytique, on dit que ce sérum hémolyse à o cc. 005 en présence de o cc. 1 d’alexine fraiche de cobaye.

Dans la réaction de fixation, il faudra employer une dose maxima de sérum hémolytique 10 & 20 fois supérieure à lu dose minima nécessaire à produire l’hémo-

‘lyse (v. p. 196). |

HT. — ALexiNE. — Il faut toujours employer, comme alexine, du sérum frais de cobaye (le sang a été recueilli

par ponction du cœur ou par saignée dans la carotide).

Mais on devra se rappeler que le pouvoir alexique est variable d’un cobaye à l’autre ; que, de plus, il s’atténue de la moitié de sa valeur initiale si l’alexine reste diluée sous le volume de 2 centimètres cubes pendant une heure (temps nécessaire à la fixation), ainsi que l’ont montré MM. Massol et Grysez (1).

L'influence du vieillissement sur la valeur de l’alexine a été également très étudiée par ces mèmes auteurs (2). Conservant dix sérums de cobayes à la glacière (température 6°), ces auteurs ont vu que leur pouvoir alexique baissait rapidement dès le deuxième jour; vers le 9° jour, un seul a conservé 5o pour 100 de sa valeur, les autres seulement 12 à 37 pour 100. Après 16 jours, les pouvoirs alexiques ont perdu de 85 à go pour 100 de leur valeur: à ce moment, l’alexine devient prati-

quement inutilisable.

MM. Massol et Grysez ont recherché aussi l'action de la dessiccalion sur l'alexine: après avoir placé des sérums de cobayes dans des boîtes de Pétri stériles et les avoir desséchés dans le vide à basse température, ils les ont broyés puis enfermés dans des flacons bouchés à l’émeri et conservés à la température du laboratoire. Le titrage de ces sérums desséchés a montré que plus la dessiccation est complète, mieux est assurée la conservation de l'activité de l’alexine. D'autre part, le pouvoir alexique baisse tout d'un coup du fait de la dessiccation; mais, par la suite, sa valeur baisse beaucoup moins vite que celle des sérums liquides: ainsi au dixième jour, sur cinq sérums étudiés, trois

(x) L. Massoc et V. Grysez. Sur les variations du pouvoir alexique du sérum frais de cobaye. Soc. de Biol., t. LXVIIT, p. 588, 9 avril 1910. (2) L. Massoz et V. Grysez. Soc. de Biol., 14 mai 1910, p.85.

avaient conservé leur valeur initiale. Après le 20° jour, les alexines desséchées ont perdu de 80 à 90 pour 100 de leur valeur ; dans la suite, le pouvoir alexique varie peu. Ces alexines sèches semblent par conséquent susceptibles de rendre des services quand on ne peut se procurer de l'alexine fraîche du jour même ou de la veille.

Un autre procédé a été indiqué par MM. Massol et Nowaczinsky (1) pour empêcher l’affaiblissement rapide du pouvoir alexique. Ces auteurs ont en effet constaté que l'hypertonicité du sérum conservait ce pouvoir dans une certaine mesure. Aussi conseillent-ils d'ajouter au sérum frais 1/10° de son volume d'eau salée saturée (36 grammes de chlorure de sodium par litre d’eau), c'est-a-dire que le mélange sera quatre fois tonique. Ce taux de sel n'aura aucun inconvénient puisque, pour exécuter la réaction de fixation, on dilue le sérum de cobaye à l’eau salée physiologique ; il suffira donc de faire la dilution avec de l’eau distillée qui rendra la tonicité normale.

Par cette méthode, le sérum de cobaye conserve son pouvoir alexique une dizaine de jours; après dix-huit jours, il possède encore 75 pour 100 de sa valeur, et au bout de 25 jours, encore

29 pour 100.

On voit, d’après ces résultats, qu'il est indispensable de titrer les alexines avant de les employer, pour déterminer la dose minima active, variable avec chaque alexine, qui permeitra de déceler les plus faibles traces de sensibilisatrices. Il faudra en outre se rappeler qu’äprès une heure de dilution sous le volume de 2 centimètres cubes (temps nécessaire à la fixation) cette dose minima est environ 2 fois plus grande que celle déterminée immédiatement (Calmette, Massol et Grysez).

(1) L. Musso ot J. Nowacsinskyx. Soc. de Biol., 19 nOY. 1910.

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