I -— SOLUTIONS D'HÉMOGLOBINE DE CHEVAL

1° Récolte du sang. — Nous avons fait nos prélèvements sur des chevaux normaux de l’Institut Pasteur municipal de Bordeaux. La technique employée fut la suivante :

Le matériel nécessaire est constitué d’un fort trocart avec mandrin, d’un long tube de caoutchouc armé à l’une de ses extrémités d’un embout adaptable au trocart, et de flacons de 1.500 cc., contenant des billes de verre et fermés par un tampon de coton, traversé par une canule que l’on peut aisément insérer dans l’autre extrémité du tube de caoutchouc.

Le cheval étant à jeun depuis douze heures, on le ponctionne à la jugulaire avec le trocart muni de son mandrin et, ce dernier enlevé, on met le trocart en communication avec le flacon récepteur. Il faut remuer ce dernier pendant que le sang couie et veiller à ne pas le remplir au delà des 2/3 afin de pouvoir agiter plus efficacement par la suite. Il est très facile de recueillir ainsi du sang dans plusieurs flacons au cours d’une même saignée, sans faire de fautes d’aseptie, puisqu'il suffit de retirer l'extrémité du tube de caoutchouc de la canule d'un premier récipient et de l’adapter à celle d’un second, et de celle d’un second à celle d’un troisième et ainsi de suite, ce qui peut se faire sans que les surfaces intérieures des conduits soient souillées.

Lorsque les flacons sont convenablement remplis, on enlève leur bouchon de coton et on les remplace par des bouchons de caoutchouc plein, puis on secoue vigoureusement les récipients jusqu’à défibrination complète. Le temps nécessaire est d’au moins vingt minutes.

Au lieu de défibriner Par agitation en présence de perles de verre, nous avons essayé d'utiliser le citrate de soude

comme anticoagulant, mais les résultats ne furent pas bons. Les globules sédimentent mal, dans ces conditions, et les solutions d’hémoglobine, malgré les lavages successifs des hématies, restent visqueuses.

La défibrination étant faite, on sépare le sang des coagulats de fibrine par filtration sur une toile métallique stérile à mailles très serrées et on laisse sédimenter les hématies, puis on décante soigneusement le plasma par aspiration à travers une pipette Pasteur reliée à un gros récipient stérile, lui-même en relation avec une trompe à eau.

2° Lavage des hématies. -— On remplace alors le sérum enlevé par de l’eau salée à 9 p. 1.000. On mélange; on répartit dans des tubes à centrifuger bouchés, d’une capacité unitaire de 250 cc. et on centrifuge une demi-heure. Puis on enlève le liquide surnageant par aspiration comme il a été indiqué ci-dessus. A la partie supérieure du culot d’hématies se trouve un mince voile de globules blancs qu’on élimine également.

On remplace l’eau de lavage rejetée par une nouvelle quantité équivalente de sérum physiologique; on homogénéise, et on centrifuge à nouveau.

L'opération est renouvelée trois fois de suite. On obtient finalement un culot d’hématies lavées.

3° Transformation des hématies en solution d'hémoglobine. — Pour extraire des hématies lavées l’hémoglobine, il suffit d'ajouter dans chaque tube un volume d’eau distillée glacée au moins égal au volume des hématies.

Nous avons toujours utilisé de l’eau glacée, parce que l’hémolyse est ainsi plus totale et plus complète comme la montré Amberson. Elle s'effectue d’ailleurs très rapidement.

Nous avons également toujours ajouté à nos solutions, aussitôt après l’addition d’eau glacée, 1/10° du volume total d’éther sulfurique. Cette pratique, recommandée par Frouin en 1907, a pour but d'enlever à l’hémoglobine la propriété de former des hémolysines spéci-

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fiques par injection à des animaux d'espèces différentes. :

Après avoir agité soigneusement le mélange, au bout de dix minutes, on centrifuge pour éliminer les débris d’hématies et les albumines précipitées.

Le liquide surnageant est une solution d’oxyhémoglobine dont le titre varie de 14 à 18 p. 100 selon les chevaux dont provient le sang. Il est aisé éventuellement de ramener de telles préparations à des titres inférieurs par simple dilution.

Pour éliminer l’éther de nos solutions, nous les mettions simplement, au début, en bloc, dans un Kitasato en relation avec une trompe à eau. C’est le procédé qu’employait . Sappey. Mais nous nous sommes rapidement rendu compte qu’il était infidèle. Et les phénomènes d’excitation qu’a constatés cet auteur chez les chiens auxquels il venait d’injecter des solutions ainsi préparées étaient dus à ce qu’elles contenaient encore de l’éther. Certains accidents toxiques surajoutés à ceux de l’hémoglobine semblent également pouvoir résulter de cette insuffisance de déséthérisation.

D’autre part, la centrifugation même prolongée des solutions ne permet pas d’éliminer complètement par simple décantation toutes les capsules globulaires. Le culot de telles solutions, centrifugées « à mort », montre encore leur présence, ainsi que celle de petits cristaux sur lesquels nous reviendrons ultérieurement.

Pour éviter ces inconvénients, nous avons en principe opéré de la façon suivante :

La solution d’hémoglobine est placée dans un filtre Seitz sur lequel on a monté un filtre filtrant, le tout stérilisé. Au bec inférieur de l’armature métallique du filtre, on adapte un Kitasato attelé par ailleurs à une pompe à vide électrique. Par aspiration l’hémoglobine filtre, tombe goutte à goutte et, sous l'influence du vide très poussé, chaque goutte est débarrassée instantanément, durant le temps de sa chute, de l’éther qu’elle contenait en solution.

L'action du vide est même telle qu’une partie de l’oxygène combiné à l’hémoglobine est lui-même éliminé, et que l’on obtient des solutions brun rougeâtre; quand toute l’hémoglobine est filtrée, une simple agitation au contact d’air filtré sur coton redonne à la solution sa couleur purpurine.

Les filtres Seitz filtrants ne suffisent pas à assurer la stérilisation. Or, pour réaliser des préparations d’hémoglobine telles qu’il est indiqué ci-dessus, les manipulations sont nombreuses et délicates, nécessitant parfois des transvasements. Des souillures, malgré les précautions prises, peuvent être apportées. Afin d'éviter ces inconvénients, nous avons procédé, chaque fois qu’il fut possible de le faire, à une stérilisation de ces solutions par deuxième filtration sur filtre stérilisant cette fois, en nous mettant d’ailleurs dans les mêmes conditions d'aspiration que ci-dessus.

L'expérience nous a permis de faire les remarques suivantes

a) Les solutions filtrées perdent généralement 1/10° de leur teneur en hémoglobine : de là la nécessité de n’ajuster la solution d’hémoglobine qu’après stérilisation.

b) La filtration des solutions à 14 p. 100 s'effectue avec une extrême lenteur. Il faut environ six heures pour obtenir 100 à 150 cc. Comme nous avions besoin d’un volume souvent beaucoup plus important pour nos expériences, nous n’avons pu stériliser nos préparations d’hémoglobine à 14 p. 100, d’autant plus qu’à la longue le filtre Seitz se laisse traverser par les germes et que l’opération n'offre plus aucune garantie. Etant donné la facilité d’altération de l’hémoglobine, nous nous sommes astreints, dans ces conditions, à utiliser les fortes solutions dans les douze heures suivant la fin de leur préparation. Pendant tout ce temps elles étaient maintenues à une température de + 4°.

Les solutions d’oxyhémoglobine de titre voisin de 7 ou 3 p. 100 filtrent parfaitement. On obtient en moyenne 500 cc. en trois heures. La température extérieure joue d’ailleurs

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un rôle important à cet égard. Des filtrations effectuées certains jours d'hiver dans le laboratoire non chauffé s’avérèrent interminables. Comme nous le verrons plus loin, c’est une simple question de viscosité.

c) Des bouillons de cultures solides et liquides ensemencés avec de telles solutions d’hémoglobine après chaque préparation n’ont jamais poussé, même au bout de plusieurs jours.

d) Avant l’usage, la solution d’hémoglobine fut toujours agitée en présence d’air filtré sur coton. Le titre en fut déterminé par l’hémoglobinimètre de Zeiss. Des dosages de l'oxygène combiné, effectués avec l’appareil d’Haldane, ont montré que toute l’hémoglobine était sous forme d’oxyhémoglobine, ainsi que nous le verrons ultérieurement.