A. RECHERCHES SUR L'HÉMOGLOBINE ET SES DÉRIVÉS

Trois questions ont été principalement abordées dans ces recherches : la capacité d’oxydation de la méthémoglobine pour les réducteurs, — ou suivant la terminologie alors en cours, «la teneur en oxygène de la méthémoglobine», — le mécanisme de la méthémoglobinisation sous l’action de certains agents : le ferricyanure de potassium, l’alcool, 1 hydroxylamine ; et le rôle physiologique de la méthémoglobinisation dans certaines intoxications, celle par l’huile d aniline en particulier.

La première question et une partie de la seconde ont été étudiées en collaboration avec mon Maître le Professeur M. Nicloux, et l’ensemble du travail a été fait sous sa direction.

a) «Teneur en oxygène de la méthémoglobine » [ 7 , 8 , 9 , 17 ].

Les réducteurs transforment l’oxyhemoglobine en hémoglobine en lui empruntant son oxygène. Les mêmes corps font passer la méthémoglobine à l’état d’hémoglobine, aussi a-t-on pris l’habitude de considérer que la méthémoglobine «contient de l’oxygène» alors que sa réduction, comme 1 a indique /. B. Connant, s’effectue peut-être sans mettre en jeu de 1 oxygène fixé sur ce pigment, par un mécanisme analogue à celui de la réduction du ferricyanure de potassium en ferrocyanure. Dans nos

publications nous avons conservé l’expression classique «teneur en oxygène de la méthémoglobine», bien qu’elle ne corresponde en réalité qu’à une capacité d’oxydation du pigment pour les réducteurs, et cela aux dépens d’oxygène dont nous ignorons actuellement encore la source.

De nombreux travaux antérieurs aux nôtres ont fait de la méthémoglobine un composé renfermant plus, autant, ou moins d’oxygène que 1 ’oxyhémoglobine.

Nous avions cru devoir fixer la quantité d’oxygène de la méthémoglobine à la moitié de celle contenue dans l’oxyhémoglobine et cela grâce à des expériences simples, dont l’exactitude a été confirmée par Conant et Fieser, par Balthazard et Philippe, mais dont l’interprétation doit être aujourd’hui réservée.

La première série d’expériences consistait à soustraire à de la méthémoglobine, au moyen d’une solution d’hydrosulfite de soude titrée, un volume a d’oxygène ; l’hémoglobine ainsi formée est agitée au contact de l’oxyde de carbone pur et on constate que le volume de ce gaz fixé est égal à 2a, comme le serait également le volume d’oxygène fixé par agitation à l’air après l’action du réducteur. On en déduit logiquement que l’hémoglobine provenant de la méthémoglobine par soustraction du volume a d’oxygène est capable de fixer ensuite 2 a d’oxygène pour donner de l’oxyhémoglobine. Le premier pigment renfermerait donc la moitié de l’oxygène du second.

Dans la seconde série d’expériences, en employant une solution d’hydrosulfite de soude titrée, on soustrait à des volumes égaux d’une solution d’oxyhémoglobine et d’une solution de méthémoglobine de même concentration, tout l’oxygène des pigments. Un tour de main expérimental permet de déceler dans

les deux cas un léger excès 'd’hydrosulfite qui indique que la réduction est complète. On constate dans ces conditions que la quantité de réducteurs nécessaire à la réduction totale de la méthémoglobine est égale à la moitié de celle nécessaire à la transformation quantitative de l’oxyhémoglobine en hémoglobine.

Devant ces faits, nous avions admis en 1925 qu’en assignant à l’oxyhémoglobine la formule schématique HbO 2 , la méthémo globine devait avoir pour formule HbO.

L’interprétation alors adoptée doit aujourd’hui être regardée comme incertaine. En effet, les arguments sur lesquels elle est basée reposent sur l’équation d’oxydation de l’hydrosulfite de soude établie par Schutzenberger et Risler dans le cas de la réaction du réducteur avec l’oxygène dissous. Nous avons établi que cette équation s’applique à l’action de l’hydrosulfite de soude sur l’oxyhémoglobine. Mais, selon Conant, lorsque l’on offre à l’hydrosulfite de soude de l’oxygène combiné, sous formes d’oxydes métalliques par exemple, il s’oxyde suivant une équation toute autre, en fixant deux fois moins d’oxygène que dans le premier cas. Or la méthémoglobine reagirait avec l’hydrosulfite de soude non pas comme l’oxyhérrioglobine, mais comme un oxyde métallique. Aussi, suivant Conant, lorsque M. Nicloux et moi avons cru soustraire à de la méthémoglobine un volume a d’oxygène (par l’emploi d’une solution d hydrosulfite de soude titrée vis-à-vis de l’oxygène de HbO 2 ) nous n enlevions en réalité qu’^ a, ce qui nous obligerait à assigner à laméthémoglobine la formule Hb 2 0 (Conant).

Il est actuellement difficile de décider quelle est la plus exacte de ces deux interprétations. Les vues de Conant se justifient avant par les arguments tirés de l’étude du potentiel

d’oxydo-réduction de solutions de méthémoglobine. Mais elles n’expliquent pas des faits, contrôlés par Quagliariello et par nous-mêmes, comme par exemple le dégagement de la moitié de l’oxygène de l’oxyhémoglobine lors de la transformation de ce pigment en méthémoglobine par l’action des acides. L’hypothèse et les nouveaux faits expérimentaux qui coordonneront ces observations restent encore à trouver.

b) Sur le mécanisme de la mêthémoglobinisation in vitro.

M, Nicloux et moi avons étudié l’action méthémoglobinisante du ferricyanure de potassium sur l’oxyhémoglobine, et essayé d’établir l’équation de cette réaction, afin de fixer les quantités d’oxydant qu elle met en jeu.

J’ai ensuite étudié l’action de l’hydroxylamine sur le pigment sanguin et essayé d’établir l’équation de la réaction. J ai constaté que l’hydroxylamine se comporte à la fois comme agent méthémoglobinisant et comme réducteur de la méthémoglobine formée.

J’ai en outre étudié l’évolution dans le temps de la méthémoglobinisation du sang par l’alcool, l’huile d’aniline, la poudre d’aluminium ; cette dernière permet d’obtenir une transformation importante du pigment in globulo.

La différence entre la mêthémoglobinisation in ou extra globulo ne parait plus devoir être retenue comme base d’une classification des agents méthémoglobinisants. (G. Hayem). c) Mêthémoglobinisation in vivo [7, 63].

Ces recherches ont porté sur l’action méthémoglobinisante de l’ingestion ou de l’injection d’aniline ou de triaminophénol.

1) Intoxication par l’aniline. — Chez le chien, la méthémoglobinisation du sang par l’aniline s’effectue, à doses et à températures égales, avec une vitesse beaucoup plus grande in vivo qu’in vitro. L’intoxication par ingestion d’une dose non mortelle provoque une méthémoglobinisation qui atteint en trois à cinq heures un maximum, regresse lentement et disparaît en vingt quatre heures. Dans l’intoxication mortelle, la mort survient lorsque 60 pour 100 environ du pigment sanguin ont été transformés en méthémoglobine. Étant donné que, dans l’intoxication oxycarbonée, un «bloquage» de la même proportion de pigment détermine la mort par une anoxémie (Balthazard et Nicloux) il est probable que, dans mes expériences, l’intoxication par l’aniline a provoqué la mort par le même mécanisme.

2) Intoxication par le triaminophénol. — L’injection intraveineuse d’une dose mortelle de ce poison provoque la mort instantanée des animaux, dont une faible partie du pigment sanguin est méthémoglobinisée. Au contraire l’injection intrapéritonéale des mêmes doses détermine une mort plus lente, la méthémoglobinisation portant alors sur les deux tiers environ du pigment sanguin. Aussi l’anoxémie doit elle, dans le second cas seulement (pénétration lente du poison dans les vaisseaux), être rangée parmi les causes de la mort.

HÉMOCHROMOGÈNES ET HÉMATINE [7, 19, 20 r 21].

J’ai étudié la combinaison réduite et des hémochromogènes avec l’oxyde de carbone et l’oxygène.

Dans une première série d’expériences j’ai établi que l’hémochromogène oxycarboné, composé stable vis-à-vis du vide, se

décompose sous l’action des acides concentrés en libérant son oxyde de carbone. Cette propriété a permis d’établir une méthode de dosage du groupement prosthétique de l’hémoglobine, dont le principe est le suivant :On réduit le pigment par 1 hydrosulfite de soude et on le sature d’oxyde de carbone. L’hémochromogène ainsi obtenu, placé dans le vide, est traité par 1 acide phosphorique. L’oxyde de carbone dégagé quantitativement est dosé par eudiométrie. Toutes ces manipulations se font dans l’appareil de Nicloux.

Comme l’hématine ne se combine pas à l’oxyde de carbone, cette méthode permet de doser spécifiquement l’hémochromogène mélangé à l’hématine. La transformation de l’hématine en hématine réduite ou en hémochromogène exige dans les deux cas la même quantité d’hydrosulfite de soude. La combinaison du groupement prosthétique à un corps azoté n’entraîne donc aucune modification de la valence du fer qu’il contient. A égalité de teneur en fer, un même volume de solution d’hématine ou d’oxyhémoglobine nécessitent la même quantité d’hydrosulfite de soude pour réduire entièrement ces pigments, alors que la méthémoglobine en exige, la moitié moins pour une masse de pigment contenant autant de fer.

Si l’on s’en tenait à l’opinion de P. Schutzenberger sur l’oxydation de l’hydrosulfite de soude il faudrait admettre que la valence du fer est la même dans l’oxyhémoglobine et dans l’hématine. On a vu plus haut qu’une pareille interprétation doit actuellement être considérée comme incertaine.

Par ailleurs, l’hématine réduite et l’hémochromogène possèdent la même capacité de combinaison pour l’oxyde de car-

bone .fait que des recherches de R. Hill ont récemment confirmé.

L’hématine, tant diacide que mono ou dibasique, exige pour être réduite la même quantité d’hydrosulfite de soude et, dans ces trois cas, elle se combine après réduction à la même quantité d’oxyde de carbone. Puisque la copulation de l’hématine avec la globine fait apparaître les propriétés spéciales de l’hémoglobine, tandis que la salification du groupement prosthétique ne modifie en rien ses propriétés primitives, il n’y a pas lieu d’admettre avec Steudel et Peiser que le groupement prosthétique, dans l’hémoglobine, est lié à la protéine par une simple salifica- L’hémoglobine n’est pas, comme l’ont supposé ces auteurs, teurs, un simple «hématinate de globine».

J’ai eu l’occasion au cours de ces recherches de m’élever contre le point de vue d'Anson et Mirsfyy faisant de l’hématine «une protéine conjuguée, forme oxydée de l’hémochromogène» et de montrer son inexactitude, laquelle a depuis lors été reconnue par l’école anglaise.

PIGMENTS DE SYNTHÈSE: CATHÉMOGLOBINE ET MÉTHÉMOGLOBINE.

La synthèse de l’hémoglobine à partir du mélange d hématine et de globine a fait l’objet de nombreuses recherches dont les résultats sont contradictoires. La possibilité de cette réaction, confirmée par Ham et Balean, Steudel et Peiser, Anson et Mirsky est, par contre, infirmée par Menzies et par Haurowitz, qui établissent que le spectre observé n’est pas celui de la méthémoglobine, mais celui de la cathémoglobine. Cette question a pris un

fout nouvel aspect à la suite des travaux de Hill et Holden et de Keilin . Hill et Holden ont montré que les préparations de protéine employées par leurs devanciers contenaient une globine «dénaturée» et ils ont donné un mode de préparation d’une globine «naturelle» qui, pour eux, est identique à celle qui fait partie de l’hémoglobine. Alors que la première, mélangée à une solution d’hématine neutre, donne de la cathémoglobine, la seconde donne, dans les mêmes conditions, de la méthémoglobine qu’on peut réduire en Hb, puis transformer en HbO 2 . Keilin a confirmé ces expériences de Hill et Holden.

Je suis arrivé à la conclusion ferme que les mélangés d’hématine dissoute (de P H = 7,5 à 9). et de globine, en solution (à pH = 8,5), ou précipitée (à pH = 8 - 7,5présentent, après quel ques heures de séjour à 0°, un spectre voisin de celui d’HbO 2 . Lorsqu’on fait agir sur ces mélanges l’hydrosulfite de soude, le spectre de l’hémochromogène apparaît. Donc le mélange d hématine neutre ou alcaline et de globine (préparée suivant les procédés de Schultz ou de Van Klaveren) conduit à la cathémoglobine. Mais cette combinaison parait spécifique de la globine, car je n’ai pas pu l’obtenir avec d’autres protéines (thymohistone, nucléohistone, clupéine, salmine, protéine de l’hémocyamne, caséine, ovalbumine, sérumalbumine, sérumglobuline).

J’ai ensuite reproduit le travail — résumé plus haut — ae Hill et Holden : l’exactitude des observations des auteurs anglais est à mes yeux indiscutable. J’ai réalisé la formation du complexe à spectre de méthémoglobine avec des hématines de cheval, de bœuf, d’homme, de poule et des globines d’homme, de cheval, de bœuf, de porc, de mouton, de lapin. Dans tous ces cas, la combinaison se fait avec une égale facilite.

Ce pigment de synthèse est bien de la méthémoglobine, car j’ai observé qu’il donne naissance : a) par addition de NaF à de la fluorométhémoglobine, b) par réduction, puis agitation à l’air à de l’oxyhémoglobine ; c) par réduction puis agitation au contact de CO, à de la carboxy hémoglobine. Les gaz fixés sur ces deux dernières combinaisons ont été isolés et caractérisés.

B. RECHERCHES SUR LES SUBSTANCES RÉDUCTRICES, LES COMBINAISONS PHOSPHORÉES ET LA GLYCOLYSE DU SANG.