SUBSTANCES RÉDUCTRICES DU SANG

Une partie de ces recherches a été faite en collaboration avec le Professeur R. Ege de Copenhague.

a) Sur le «reste de fermentation » et sur les glucides globulaires du sang humain. [49, 50 , 51 , 52 , 59].

Nous avons étudié (') la valeur de la glycémie, du «reste de fermentation)) et du «reste de glycolyse» dans le sang total, les globules et le sérum du sang défibriné, en utilisant sur divers échantillons d’un même sang les méthodes de Fontes et Thi- Volle (défécation tungstique) et de Hagedorn et Jensen (défécations tungstique et zincique). La comparaison des résultats obtenus montre que l’on dose ainsi des quantités différentes de substances réductrices dans le sang, même lorsqu’on opère avec la

(‘) À l'aide d’une tedmique mettant en œuvre de la levure en quantités minimes» se prêtant bien à la défécation, et n’apportant avec elles que des traces de substances réductrices.

même méthode, sur des filtrats de déprotéinisations différentes. La glycémie dosée par la méthode de Hagedorn et Jensen sur un filtrat de défécation tungstique est plus élevée que celle dosée par la méthode de Fontes et Thivolle sur le même filtrat, mais la valeur de la glycémie obtenue dans ce dernier cas est supérieure à celle dosée dans le filtrat de défécation zincique par la méthode de Hagedorn et Jensen. La cause de ces différences demeure actuellement obscure.

Dans le sang total, le «reste de fermentation» déterminé par la méthode de Hagedorn et Jensen est de l’ordre de 0,015 gr. de substances réductrices exprimées en glucose pour 100 cc. de sang, dans les filtrats de défécation zincique et d’environ 0,030 gr. pour 100 cc. de sang dans les filtrats de défécation tungstique. Il est, dans ces mêmes filtrats, de l’ordre de 0,004 gr. pour 100 cc. de sang, lorsqu’on emploie la méthode de Fontes et Thivolle. Ces différences expliquent pour une part les discordances entre les résultats ou l’opinion de nombreux auteurs sur la grandeur et sur l’existence même du reste de fermentation du sang.

Le taux des substances réductrices non glycolysables du sang est du même ordre de grandeur que celui du reste de fermentation, et les substances réductrices non glycolysables ne sont pas fermentescibles.

Le taux du reste de fermentation n’est influencé ni par le jeûne, ni par l’exercice, ni par l’injection d’insuline. Cette constance nous a conduit à penser que ce reste se trouve principalement dans les hématies, dont la composition est en général moins variable que celle du plasma. Nos résultats et ceux publiés simultanément par Somogyi montrent qu’il en est bien ainsi, quelle que soit la méthode de dosage employée. Notons à ce propos

que la quasi-totalité du reste de fermentation accessible à la méthode de Fontes et ThiVolle est contenue dans les globules.

Les substances réductrices du globule rouge humain sont constituées par deux fractions, l’une fermentescible et diffusible (glycose), l’autre non diffusible et non fermentescible (reste de fermentation) représentant environ 25 pour 100 du pouvoir réducteur des globules dosé par la méthode de Hagedorn et Jensen.

Des expériences sur la perméabilité de l’hématie humaine in Vitro, ont montré que le glucose du globule humain est complètement diffusible et qu’il n’existe pas de glucose adsorbé à la paroi globulaire comme l’avaient suggéré R. Ege et K. M. Hansen et admis d’autres biochimistes.

Nous estimons avec la majorité des auteurs que, chez l’homme, à l’état normal, le «sucre sanguin» dosé par la méthode de Hagedorn et Jensen sur filtrat de défécation zincique est également réparti entre les globules et le plasma. Or, si la diffusion du glycose à travers la membrane globulaire réglait seule cette répartition il n’en serait pas ainsi, car la teneur en eau des globules est inférieure d’environ 15 à 20 p. 100 a celle du plasma et il devrait en être de même du taux des substances réductrices.

L’existence d’un reste de fermentation plus élevé dans les globules que dans le sérum, non diffusible des premiers vers le second, permet de comprendre pourquoi, maigre la moindre teneur en eau des globules, leur pouvoir réducteur est du meme ordre de grandeur que celui du sérum (ou du plasma). En effet, la répartition du glucose dans les divers éléments du sang humain se fait suivant les lois de la diffusion. Sa concentration est donc identique dans les phases aqueuses du globule et du sérum ; par contre, le reste de fermentation est plus eleve dans les

globules que dans le plasma ; aussi les substances réductrices totales (glucose + reste de fermentation) sont-elles également réparties entre les deux phases du sang.

b) Participation de corps phosphores au pouvoir réducteur du sang [64].

Le «reste de fermentation» des hématies, riches en combinaisons phosphorées acidosolubles, est beaucoup plus élevé que celui du sérum ou du liquide céphalo-rachidien (Bigwood et Wuillot) très pauvres en phosphore combiné. J’ai constaté que celui du corps vitré de l’œil, milieu pratiquement dépourvu de combinaisons phosphorées organiques, est aussi très faible, (0,003 gr. pour 100 avec la méthode de Hagedorn et Jensen après défécation zincique). Au contraire, ce reste est particulièrement élevé dans certaines hématies exceptionnellement riches en phosphore acidosoluble, celles du pigeon par exemple.

Des expériences faites avec l’acide adénylique, nucléotide présent dans les hématies ( Hoffmann ) montrent que ce corps, partiellement hydrolysé au cours des manipulations nécessaires au dosage du glucose sanguin ( Hagedorn et Jensen), participe à la glycémie et au reste de fermentation. Comme ce corps n’est pas déféqué par l’acide tungstique et l’est par l’hydrate de zinc il est probable qu’il est en partie la cause de l’excès de la «glycémie tungstique» sur la «glycémie zincique». Il constitue 8 à 10 pour 100 du reste de fermentation du sang humain et 20 pour 100 de ce même reste dans le sang de pigeon.

L’acide diphospho a-cétotrioxyadipique {Posternak) doit également participer au reste de fermentation des globules, mais pour une part actuellement indéterminée.

Il en est de même de quantités minimes d’acides hexosephosphoriques et glycuronique.

2. — COMBINAISONS PHOSPHORÉES («PHOSPHORE ACIDOSOLUBLE») ET CONSTITUANTS ÉLÉMENTAIRES DES FILTRATS DE SANG DÉPROTÉINISÉ.

Afin de poursuivre la séparation des diverses combinaisons phosphorées des filtrats sanguins, dont l’ensemble est en général désigné sous le nom de «phosphore acidosoluble» du sang, j’ai été amené à étudier les constituants élémentaires en particulier le carbone des filtrats de sang déféqué.

a) Carbone total des filtrats de sang déféqué [«, 47],

Je l’ai étudié à l’aide d’une application de la microméthode de Nicloux [46]. Voici les faits observés :

A de rares exceptions près, la teneur en carbone total et le rapport C/N des filtrats sanguins présentent chez les sujets d’une même espèce le même ordre de grandeur.

Le sang humain contient environ 1,2 à 1,5 gramme de carbone non précipitable par les réactifs de défécation (sels de mercure ou acide phosphotungstique) et le rapport C/N des filtrats est d’environ 4,2.

La teneur en carbone des globules est plus élevée que celle du sérum .mais le rapport C/N est légèrement plus élevé dans le sérum que dans les globules.

Le carbone des divers composés actuellement dosables dans les filtrats de sang déprotéinisé (glucose, acides lactique et urique, urée, créatine et créatinine, acides aminés) ne représente que

70 pour 100 au plus du carbone total, comme l’avait déjà signalé W. Stepp.

b) Sur la séparation des constituants du «phosphore acidosoluble du sang [64].

Dans les filtrats de sang déféqué concentrés dans le vide à 30°, l’addition de baryte à saturation provoque la précipitation de 15 à 20 pour 100 du carbone, de 10 pour 100 de l’azote et de la presque totalité du phosphore. Les combinaisons phosphorées ainsi précipitées peuvent être séparées en bloc de leur solution chlorhydrique sous forme de composé plombiques à partir desquels j’ai pu préparer l’acide diphosphoglycérique (précédemment isolé par Greenwald, Machebœuf, Jost) et l’acide adénylique (isolé pour la première fois par Hoffmann et, après lui par de nombreux auteurs).

La plus grande partie des substances précipitables par la baryte dans les filtrats sanguins n’est pas constituée, comme 1 a avancé Deutschberger, par des acides oxyprotéiques, mais par diverses combinaisons phosphorées.

Le pouvoir réducteur des substances précipitées par la baryte n’est pas dû exclusivement aux acides hexosephosphoriques (Lawaczek). Ces substances comprennent en effet, entre autres composés réducteurs, du glycose et de l’acide glycuronique. Les «dosages de lactacidogène» faits dans le sang par Lawaczek en dosant le pouvoir réducteur des substances précipitables par la baryte sont donc sans valeur.

Il existe vraisemblablement des traces d’un acide hexophosphorique dans le sang (2 à 3 pour 100 des substances réductri-

ces, 5 à 10 pour 100 du reste de fermentation et 5 pour 100 du phosphore acidosoluble au plus). L’osazone de ce corps n’a pu être obtenue à l’état pur, mais des osazones phosphorées ont été préparées à partir des constituants sanguins précipitables par la baryte.

Le phosphagène n’a pas pu être décelé dans le sang.

Le sang contient des pyrophosphates en petite quantité (environ 1 mgr P. pour 100 ce.); j’en ai isolé à l’état pur suivant la technique de Lohmann.

La fraction des substances précipitées par la baryte insoluble dans l’acide chlorhydrique à 10 pour 100 contient une combinaison phosphorée nouvelle, non identifiée contenant par atome de phosphore un atome d’azote et sept ou huit atomes de carbone. Cette substance — ou ce mélange de substances — contient 6 à 8 pour 100 du phosphore acidosoluble. Sa constitution est actuellement à l’étude.

3. RECHERCHES SUR LA PARTICIPATION D’UNE COMBINAISON PHOSPORÉE A LA GLYCOLYSE DU SANG [35, 36, 45].

Elles ont été faites en collaboration avce Andrée Roche. Leur but était d’établir si la glycolyse du sang in vitro comporte la participation d’une combinaison phosphorée.

L’action favorisante d’une addition de phosphates sur la glycolyse du sang in vitro a, dès sa découverte, suggéré à von Euler, à Rona l’idée que la glycolyse doit être reliée à la formation d’un éther phosphorique du glucose ou de 1 un de ses produits de dégradation : Les divers auteurs qui, avant nous,

ont essayé de confirmer ou d’infirmer cette hypothèse sont en complet désaccord sur sa validité, comme il ressort des travaux de Bierry et Moquet, Morgulis et Barbus, Irwing, Rona et Iwasa\i.

Nous avons repris l’étude de ce problème en faisant porter nos recherches sur la glycolyse et sur les variations simultanées des phosphates dans le sang de chien soumis à diverses conditions expérimentales où la glycolyse est normale, accrue, diminuée ou arretee, afin d établir 1 existence ou la non existence d’un rapport entre l’action de l’enzyme glycolytique et celle de la phosphatase. Voisi le résumé des expériences poursuivies et des résultats obtenus :

1 ) Dans 45 courbes horaires de glycolyse à 38 0 , on a noté : dans 29 cas une diminution nette des phosphates au cours des trois premières heures d etude, dans 7 cas une absence presque totale de variations, dans 9 cas une légère augmentation des phosphates. Après la troisième heure d’étude, les phosphates ont augmenté de façon importante dans chaque sang. Or, c’est dans les trois premières heures que la glycolyse est la plus intense.

Dans la plupart des cas, dans les conditions où nous avons opéré tout au moins, on saisit directement la synthèse d’une combinaison phosphorée simultanée au début de la glycolyse. Mais les observations qui ne sont pas par elles mêmes démonstratives à cet égard ne peuvent pas non plus permettre de conclure que cette synthèse n a pas lieu. En effet, ce que l’on saisit par les variations de la phosphatémie est la résultante de deux réactions,

1 une fixant des phosphates par synthèse de composés phosphorés, 1 autre libérant des phosphates par dégradation de combinaisons, qui ne sont pas forcément les mêmes que les premières.

Dès lors, si l’existence d’une diminution des phosphates du sang au cours de la glycolyse peut être tenue pour une synthèse de combinaisons organiques de l’acide phosphorique, la constatation d’une augmentation des phosphates du sang ne signifie pas nécessairement que la réaction de synthèse n’ait pas lieu. Les auteurs qui ont abordé avant nous ce problème n’ont pas envisagé cette conception : ils ont conclu à la synthèse ou à la dégradation de combinaisons phosphorées suivant qu’ils constataient une diminution ou une augmentation des phosphates du sang et il faut voir dans ce mode de raisonnement l’origine de leur divergence absolue d’opinion.

Ce qui ressort de cette première série d’expériences est la simultanéité de la diminution des phosphates ou de leur augmentation minima dans la période où la glycolyse est le plus intense.

2) L’apparition de la glycolyse dans un sang où elle ne s’exerçait pas (sang placé d’abord à +2°, puis à 38° ; ou sang glycolysé aseptiquement par un séjour de 16 heures à 38 0 , puis additionné de glycose) y provoque les variations du taux des phosphates notées au cours de la glycolyse du sang normal.

3) L’augmentation de la glycolyse et son accélération (addition de glucose et addition de phosphates) augmente la fixation de l’acide phosphorique libre constatée en général dans les premières heures de séjour du sang normal à 38°.

4) L’action favorisante des phosphates sur la glycolyse présente un seuil pour l’addition d’une certaine quantité de ces corps. L’existence même de ce seuil donne à penser que l’action des phosphates doit être limitée par la concentration d’un constituant du sang. Or l’addition de glucose permet de dépla-

cer le seuil de l’activation par les phosphates, la quantité de ceux-ci nécessaire pour atteindre ce seuil étant d autant plus grande que la glycémie a été plus fortement augmentée par l’addition de glucose. Pareil fait ne s’explique bien que par la formation d’une combinaison de l’acide phosphorique avec le glucose ou l’un de ses produits de dégradation.

5) Le ralentissement de la glycolyse par addition à du sang d’oxalates alcalins et son arrêt par addition de fluorure, déterminent :1e premier une diminution, le second une abolition des variations des phosphates notées dans le sang normal au cours de la glycolyse. L’addition de chlorure de calcium à du sang défibriné détermine une augmentation du taux des phosphates importante et continue au cours de la glycolyse qui demeure normale. Lorsqu’on introduit du chlorure de calcium dans du sang défibriné, oxalaté ou fluoré l’on y fait reparaître la glycolyse et des variations du taux des phosphates identiques à celles notées dans le sang normal au cours de ce processus.

L’étude systématique des phénomènes provoqués par 1 addition de sels de calcium au sang, normal, oxalaté ou fluoré a permis d’établir que ce métal est indispensable à la glycolyse et à l’action synthétisante de la phosphatase, tandis qu’il favorise l’action dégradatrice de cette dernière sans lui être indispensable.

Comme, par ailleurs, l’addition de citrates alcalins est sans action sur la glycolyse et sur les variations des phosphates du sang qui l’accompagnent, nous admettons en nous basant sur les recherches de Stewart et Percival, que c’est la partie non ionisée du «calcium diffusible» du sang qui intervient dans l’action de la phosphatase et de l’enzyme glycolytique.

L’ensemble de ces expériences légitime l’hypothèse de la participation d’une combinaison phosphorée, dont la nature reste à préciser, à la glycolyse du sang in üitro.

Accessoirement au cours de ce travail nous avons établi que le sang ne saurait contenir du méthylglyoxal qu’à l’état de traces et que ce corps ne se forme vraisemblablement pas au cours de la glycolyse.