Une deuxième méthode de séparation est

celle qui repose sur la résistance à la chaleur d’une espèce donnée ou de scs spores. On peut l’appliquer par exemple à l’isolement du Bacillus sublilis.

Les spores de celle espèce, très répandues à la surface du sol et sur les fourrages, résistent à une température de 1(30° prolongée pendant assez longtemps;

NOTIONS DE TECHNIQUE MICROBIOI.OGIOUE

celle température détruit tous les microorganismes à l’étal végétatif. On peut donc obtenir une culture pure de B. sublilis en opérant de la manière suivante :

On fait infuser dans une capsule de porcelaine un peu de foin desséché avec une quantité d’eau chaude suffisante pour le recouvrir, pendant une demi-heure. On (dire le liquide dans un matras que l'on bouche avec un tampon d’ouate, et on porte à l’ébullition pendant au moins un quart d’heure. On laisse refroidir, puis on porte à l’étuve à 35°; après vingt-quatre à quarante-huit heures, le liquide est couvert d’un voile mince dû à B. subtiLis. On examinera au microscope, d’une part un fragment du voile, de l’autre, une goutte du liquide renfermant encore de petits bacilles très mobiles souvent fixés bout à bout et donnant des filaments plus ou moins longs ( fiy . 38).

Isolement des anaérobies

330. — on réalise l’isolement des microbes anaérobies le plus commodément par la méthode suivante (Veillon et Zuber).

On prépare d’abord une macération de 250 grammes de viande dégraissée et hachée dans 500 centimètres cubes d’eau. On abandonne deux ou trois jours, puis on passe à travers une mousseline et on ajoute 5 grammes de peptone et 2gr,5 de chlorure de sodium. On chauffe légèrement en agitant, et lorsque la dissolution est obtenue, on introduit 6 grammes de gélose coupée en petits fragments, puis assez de soude à 10°/o pour que le liquide bleuisse nettement le papier de

ISOLEMENT DES ANAÉROBIES

tournesol. On chauffe alors à l’autoclave, à 120°, pendant une demi-heure. Le liquide visqueux est relroidi ensuite à 50°, et on y ajoute la moitié d’un blanc d’œuf battu dans un peu d’eau où on a lait dissoudre 7 à 8 grammesde glucose. Le mélange bien remuéest porlé de nouveau à 120° pendant quinze minutes. Le liquide bouillant, versé sur un filtre en papier Chardin, doit passer rapidement et très clair. On le répartit aussitôt dans des tubes à essai, au moyen du dispositif décrit (§ 329), de manière à ce que chaque tube soit rempli jusqu’à une hauteur de 10 centimètres environ; on bouche à l’ouate et on stérilise par chauffage de quinze minutes à 115°.

337. — Pour isoler les anaérobies contenus dans le sol par exemple, on délaie une pincée de terre de jardin dans 10 à 15 centimètres cubes d'eau, et on laisse déposer. On plonge d’autre part cinq à six tubes de gélose (préparée comme ci-dessus) dans de l’eau bouillante, de manière à liquéfier complètement la niasse, puis on les retire après cinq à dix minutes et on les maintient à 40° dans un bain-marie. Ils restent ainsi à l’état liquide, sans que la température soit mortelle pour les bactéries.

On ensemence ensuite de la manière suivante : on prend une pipette Pasteur à longue effilure, fermée, on s’en sert pour prélever une gouttelette de l'eau de lavage de terre, et on l’enfonce dans le premier tube de gélose fondue, en remuant de manière à bien mélanger. La pipette, étant retirée de ce tube, est plongée dans un second, sans être rechargée de semence ; on agite bien, on recommence avec un troisième tube, et ainsi de suite. Toutes ces opérations sontfaites avec les précautions d’asepsie habituelles.

270 MOTIONS DE TECHNIQUE iMlCKOUIOLOGIQUE

On obtient ainsi des tubes de gélose dans lesquels la semence est diluée progressivement et où lés microbes sont de plus en plus disséminés et rares. Les tubes ensemencés sont plongés aussitôt dans l’eau froide, de manière à ce que la gélose solidifiée maintienne chaque germe à sa place. Les tubes étiquetés sont alors mis à l’étuve à 35°-37°.

Si les tubes ont été bien purgés d’air par chauffage à 100°, ils contiennent peu d’oxygène; la pénétration se fait par la surface, lentement, et ne dépasse guère 1 à 2 centimètres. Dans cette zone aérée supérieure pourront se développer des aérobies, tandis que les anaérobies pousseront dans la zone profonde. Les microbes donnent naissance à des colonies que l’on voit apparaître peu à peu sous forme de points d'aspects divers.

Ces colonies, nombreuses dans les premiers tubes, doivent être rares et bien isolées dans les derniers. On peut facilement les examiner aux faibles grossissements du microscope.

Pour les isoler, il faut repérer d’un point à l’encre la colonie que l’on désire, et aller la pécher avec une pipette à longue effilure que l’on a flambée après en avoir brisé la pointe. Le tube étant placé horizontalement, on pique la pointe dans la gélose, jusqu’à ce qu’elle touche la colonie voulue; on aspire alors légèrement au moyen d’un tube de caoutchouc fixé à la pipette, et on fait pénétrer dans celle-ci tout ou partie de la colonie. On retire la pipette en évitant de toucher les colonies voisines, et on réensemence dans le milieu choisi en y soufflant légèrement la colonie isolée.

La plupart des espèces anaérobies donnent lieu, surtout en présence de sucre, à un dégagement gazeux qui