FIXATION ET COLORATION DES MICROBES

fragmente et désagrège le milieu solide ; on peut empêcher ce dégagement, dans la plupart des cas, en ajou- ■ tant au milieu de culture 0,1 °/0 de nitrate de potassium.

Fixation et coloration des microbes

338. — Pour observer les bactéries avec leur aspect réel, il est indispensable de les examiner au microscope à l’état vivant; on peut ainsi déterminer leur forme, leurs dimensions, apprécier leur motilité, etc. Cet examen se fait facilement, en déposant sur une lame porte-objet une goutte de culture en milieu liquide, recouvrant d’une lamelle, et portant sur la platine du microscope. Lorsqu’il s’agiL d’une culture sur milieu solide, on délaie une parcelle de celle-ci dans une goutte d’eau placée sur la lame, puis on recouvre et on examine. On doit employer, pour l’examen des microbes vivants, un éclairage bien réglé, un excès de lumière pouvant empêcher complètement de les apercevoir.

On obtient aussi de très bons résultats en les observant dans l’éclairage sur fond noir de l’ultramicroscope.

Pour examiner les cultures des espèces anaérobies, on dépose la lamelle avec précaution sur la goutte liquide, en évitant la formation de bulles d’air. On fait tomber sur les quatre angles de la lamelle une goutte de paraffine fondue, et on étale celle-ci avec un fragment de fil de fer recourbé légèrement chauffé, de manière à border la lamelle et à empêcher le contact de l’air avec la préparation.

Les bactéries, d’abord immobilisées, reprennent peu à peu toute la vivacité de leurs mouvements.

NOTIONS DE TECHNIQUE M ICItOlilOI.OGIQUE

339. — Lorsqu’on veul déceler la présence des bactéries dans des tissus ou parmi des fragments de substances inertes, ou apercevoir des détails de structure, il est préférable de procéder à leur coloration. Celle-ci facilite d'ailleurs dans tous les cas la recherche et l’examen des microbes.

On commence par poser sur une lame bien propre (nettoyée au moyen d’un linge lin imbibé d'eau ammoniacale) une goulle de la suspension microbienne à étudier, obtenue soit par agitation avec de l'eau, soit dans le milieu de culture, comme pour l’examen à l’état frais; on étale cette goutte en mince couche sur une surface de 1 à 2 centimètres carrés et on laisse sécher à l’air. Quand la dessiccation est obtenue, on procède à l’opération dite fixation , qui a pour but de fixer la forme et la structure des éléments cellulaires, et en même temps les fait adhérer assez étroitement au support pour que les lavages et les traitements ultérieure ne puissent les en détacher.

Pour fixer, on recouvre la lame de quelques gouttes d’un mélange à parties égales d'alcool à 96° et d’éther ordinaire; on jette ce liquide, on verse à nouveau quelques gouttes du même mélange, puis on laisse sécher à l’air.

Pour colorer, on recouvre ensuite la préparation d’une solution aqueuse saturée de bleu de méthylène, de fuchsine ou de violet de gentiane; cette solution doit être filtrée au moment île l’emploi. Après quelques instants de contact, on jette l'excès de colorant, on lave à l’eau et on fait sécher. Si la coloration est insuffisante, on recommence en prolongeant un peu le temps de contact avec la matière colorante.

DOUriLE COLORATION

Double coloration

340. — Dans certains cas, il peut être avantageux de faire une double coloration, par exemple lorsque l’on veut faire apparaître nettement des noyaux ou des spores, ou encore pour différencier des espèces bactériennes dans un mélange. Il ne s'agit pas de reproduire ici les innombrables techniques qui sont utilisées en bactériologie, mais d’indiquer simplement le principe des doubles colorations, au moyen de quelques exemples simples. D’une manière générale, on teinte d'abord l’ensemble de la préparation, fixée au préalable, par un colorant approprié; on traite ensuite par un agent de différenciation. En plaçant la préparation dans un second colorant, celui-ci ne se fixera que sur les parties précédemment décolorées. On choisit les deux couleurs de manière à avoir un contraste très net : violet et rouge, bleu et rouge, rouge et vert, etc.

341. — Un premier exemple très simple de double coloration est celui des cellules nucléées. On sait que la chromatine des noyaux fixe énergiquement les matières colorantes dites basiques : bleu de méthylène, fuchsine, etc. Si on traite d'abord la préparation par un colorant acide, comme l’éosine, l’ensemble est coloré d'une manière diffuse. En faisant alors agir un colorant basique, celui-ci déplace le premier pour se fixer électivement sur le noyau de la cellule; la double coloration est ainsi obtenue sans différenciation ni décoloration spéciales.

Les hématies nucléées du sang des oiseaux ou des reptilesse prêtent excessivement bien à celte technique.

On opérera de la manière suivante : un pigeon étant piqué à la grosse veine qui suit le bord de l’aile, on dépose une goutte du sang qui s’écoule sur une lame de verre bien propre; on étale vivement avec le bord d’une carte de visite, que l’on fait glisser à la surface de la lame, tout en soufflant pour obtenir une dessiccation rapide. La préparation est alors fixée à l’alcool absolu (que l’on renouvelle une à deux fois) pendanteinq à dix minutes. On recouvre ensuite avec une solution aqueuse d’éosine à 0,5 u/0, pendant une minute environ; ce colorant est alors jeté et remplacé par la solution aqueuse saturée de bleu de méthylène, dont l’action doit durera peu près trente secondes. On lave aussitôt à l’eau distillée, tant (pie celle-ci se colore d'une façon visible, on sèche et on examine au microscope (obj. 5 ou 8, oc. 2). Les hématies sont colorées, le noyau en bleu, le protoplasma en rose.

342. — Nous choisirons comme second exemple celui de la coloration des spores. La spore bactérienne est en général difficile à colorer et, pour y arriver, il est nécessaire de traiter préalablement par un mordant. Lorsque la coloration est obtenue, elle est également très difficile è enlever; les réactifs décolorants la respecteront, et en traitant par une seconde matière colorante convenable, cette dernière teindra les bactéries; on obtiendra ainsi la double coloration cherchée.

On peut étudier cette coloration sur un fragment de voile de Bacillus sùbtïlis de vingt-quatre à quarante-lmit heures, qui renferme des bacilles sporulés (§ 335), ou sur une préparation provenant d’une culture de ferments butyriques clu sol âgée de deux à trois jours (§ 357).

On étalé une goutte de culture (ou un fragment de

DOUlîLE COLORATION

voile, dissocié dans une goutte d’eau) sur une lame, on laisse sécher, et on fixe à l’alcool-éLher pendant deux à trois minutes. On dépose sur la préparation quelques gouttes d’une solulion d’acide chromique à 3 °/o et on laisse agir ce mordant pendant cinq minutes; on lave à l’eau, on verse plusieurs gouttes de solulion phéniquée de f'uchsine( '), de manière à couvrir complètement la préparation, et on chauffe au-dessus d’une petite flamme, jusqu’à émission de vapeurs, pendant cinq à dix minutes, en ajoutant de temps à autre quelques gouttes de colorant, de façon à ce quela préparation ne soit jamais, à sec. On lave dlors à grande eau pour enlever l’excès de couleur, et on différencie en plongeant la lame pendant trente secondes à une minute dans une solution aqueuse de chlorhydrate d’aniline à 2 °/0. On lave à l’alcool à 96°, qui décolore toute la préparation, à l’exception des spores. On examiiiëau microscope; si la décoloration est incomplète; on traite à nouveau par le chlorhydrate d’anilineet l’alcool.

La lame est alors recouverte de solution aqueuse de bleu de méthylène, de manière à colorer les bactéries; après environ une minute de contact, on lave à l’eati, oh sèche et on examine au microscope. Les microbes apparaissent en bleu, les spores doivent être colorées en rouge vif.

343. — Un dernier exemple est fourni par la méthode de coloration universellement connue sous le nom <ie méthode de Gram. Lorsque l’on traite par une solution (*)

( *) Cette solution, dite fuchsine de Ziehl, se prépare en mélangeant iO centimètres cubes d’une solution à 10 °/0 de fuchsine dans l’alcool à %° avec t)0 centimètres ciibe de solution aqueuse de phénol ordinaire â I ou 2 %. On filtre avant l’emploi.

d’iode dans l’iodure de potassium une préparation fixée et colorée (avec un dérivé de la pararosaniline) de certaines bactéries, on observe <|iie cette préparation ne se décolore plus par l'alcool absolu (bactéries prenant le Gram); avec d’autres espèces microbiennes, au contraire, ladécoloration peut êtreobtenucpar l’alcool, après traitement à l’iode (microbes ne prenant pas le Gram).

Celte méthode est très employée par les bactériologistes, parce qu’elle leur fournit un élément commode pour différencier les espèces.

Lorsqu’il s’agit d'un mélange d’espèces qui prennent le Gram (levure de bière, Saccliaromyces vini, Baeillus subtilis , etc.) avec des microbes qui ne le prennent pas (ferment acétique, etc.), on peut, après avoir décoloré ces derniers par la méthode de Gram, les teindre à l’aide d’une autre couleur; on a ainsi une double coloration qui facilite la recherche.

On peut étudier celle méthode sur le mélange de ferment acétique et de Saccliaromyces vini qui se forme leplussouventà la surface du vin abandonnéà l'air libre.

Pour cela, on délaie un petit fragment du voile contenant ces microbes dans une goutte d’eau déposée sur une lame de verre; on laisse sécher, on fixe à l’alcool absolu, pendant deux à trois minutes, puis on colore par du violet de gentiane aniliné(') pendant trois à quatre minutes. On jette l’excès de colorant et, sans laver à l’eau, on couvre la préparation de liquide de

(>) Pour obtenir ce colorant, qui doit être préparé extemporanément, on ajoute à 10 centimètres cubes de solution aqueuse saturée d’aniline un volume de solution alcoolique saturée de violet de gentiane suffisant (1 centimètre cubes environ) pour les colorer en violet foncé et opaque; on s’aperçoit que la quantité de colo-