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de cuivre trouvés. En suivant exactement la technique de M. G. Berrranp, cette méthode donne des résultats d’une grande précision, et n’est d’ailleurs guère plus longue que le procédé ordinaire à la liqueur de Fehling.

Tout mon travail a été accompli dans lelaboratoire de M. le Professeur BouRQUELOT et sur ses conseils. C’est aux côtés de ce Maitre bienveillant que, grâce à ses encouragements qui ne me firent jamais défaut un seul instant, J'ai pris le goût des recherches scientifiques. Qu'il veuille bien permettre à son élève de lui exprimer ici sa respectueuse reconnaissance et son profond attachement.

Je dois remercier aussi M. le Professeur agrégé Hérissey, dont j'ai pu apprécier bien souvent les conseils sûrs et éclairés, et mon ami H. Leroux, pharmacien des hôpitaux, qui m'a initié au maniement de son appareil électrique de combustion, appareil à la fois si rapide et si précis. ;

Je suis heureux de pouvoir adresser mes meilleurs remerciements à mes excellents confrères, M. Durour, de Gérardmer, et M. Dispier, de Grenoble, pour les plantes qu'ils ont bien voulu m'adresser avec tant d’empressement, et Mademoiselle A. FicHTENHoLZ, pour l’aide qu’elle m'a toujours apporté si amicalement dans les traductions nécessaires à toute recherche bibliographique.

Je regarde enfin comme un devoir bien doux d’exprimer, ici, à mon père, tout mon amour filial, car j'ai mis bien souvent à contribution, sans compter, sa connaissance approfondie de la flore du Loir-et-Cher et de l’Indre-et- Loire. C’est grâce à lui que j’ai pu trouver, notamment, une station importante de Trèfle d’eau, où j'ai récolté près dé cent kilogrammes de cette plante, qu'il a été possible de traiter vingt-quatre heures à peine après leur récolte,

LA MÉTHODE BIOCHIMIQUE.

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Parmi les ferments solubles hydratants, les uns n’exercent leur action que sur un seul composé, les autres, au contraire, agissent sur un nombre plus ou moins grand de principes immédiats, mais qui sont tous reliés par des propriétés communes assez étroites. En un mot, chaque ferment soluble hydratant est spécifique d’un composé ou d’une série de composés.

La méthode biochhnique de recherche des sucres et des glucosides s’appuie précisément sur cette propriété spéeifique qui permet de reconnaitre un principe immédiat ou une classe de principes immédiats par-l’action hydrolysante d’un ferment bien déterminé (1). Elle utilise deux ferments, l’invertine, ferment spécifique du saccharose Hibre ou combiné, et l’émulsine, ferment spécifique d’un certain nombre de glucosides renfermant tous dans leur molécule le glucose-d.

L’invertine est un ferment qu'on peut obtenir, sous forme de poudre, sans mélange d'autres ferments, en tuant, par l'alcool fort, la levure des boulangers ou levure haute, fraiche, suivant le procédé indiqué par M. Bour- QUELOT (2).

(1) Em. BOURQUELOT. — Recherche, dans les végétaux, du sucre de canne à l’aide de l'inverline et des glucosides à l’aide de l'émulsine. (C.R. Acad. des Sciences. CXXXIIT, p. 690, 1901). (Journ. de Pharm. et de Chim., (6), XIV, p.481, 1901).

Em. BOURQUELOT. — Sur la recherche, dans les végétaux, des gluco= sides hydrolysables par l'émulsine. (Journ. de Pharm. et de Chim. (6) XXIII, p. 369, 1906).

(2) Em. BOURQUELOT. -— Sur l'emploi des enzymes comme réaclifs dans les laboratoires. I1—hydratases. (Journ, de Pharm. ct de Chim., (6), XXV, p. 16, p. 378, 1907).

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Le choix de la levure n’est pas sans importance. E. Fischer a montré que la levure séchée à l’air possède la propriété de dédoubler l’amygdaline en glucose-d et en amygdonitrileglucoside ; elle renferme, dans ce cas, le ferment que l'on désigne sous le nom d’amygdalase. Si on emploie dans la préparation de l’invertine une levure vieille d’une semaine ou plus, cette levure renfermera des traces d’amygdalase qui pourront troubler les résultats dans le cas de l’essai d’une plante renfermant saccharose et amygdaline.

Il faut donc avoir recours à de la levure bien fraiche qui donnera une invertine inactive sur l’amygdaline (1).

L'émulsine, préparée, avec des amandes douces, d’après le procédé donné par M. HérisseY (2), est un mélange de plusieurs ferments, dans lequel se trouve en proportion plus grande que les autres l’émulsine proprement dite, c’est-à-dire le ferment qui hydrolyse les glucosides. On y a signalé, en outre, la lactase, la gentiobiase (3), la mélibiase et la manninotriase (4), ferments hydrolysant respectivement le lactose, le gentiobiose, le mélibiose, le manninotriose. :

Pour employer ces deux ferments, invertine et émulsine, il faut les faire agir successivement sur un extrait liquide, aqueux, préparé de la façon suivante :

La plante à essayer doit être traitée fraîche, la dessiccation pouvant modifier sa composition. On divise grossièrement deux à trois cents grammes du végétal et l’on fait tomber les fragments au fur et à mesure dans de

(1) Em. BourQueLorT et H. HÉRISSEY. — Du choix de la levure dans l'application des procédés biochimiques à la recherche des sucres et des glucosides. (Journ. de Pharm. et de Chim., (7), VI, p. 246, 1912).

(2) H. Hérissey. — Recherches sur l’émulsine. (Thèse Doct. Univ. (Pharmacie), Paris 1899).

(3) Em. BourQuELOT et H.HÉRISSEv.—C. R. Soc. de Biologie, p. 213,1903.

(4) J. VINTILESCO. — Etude de l’action des ferments sur. le stachyose (Journ. de Pharm. et à2 Chim.,(6), XXX, p. 167, 1909).

l'alcool à 90° bouillant qu'on a additionné, au préalable, d’une petite quantité de carbonate de calcium. L'emploi de l'alcool bouillant a pour but de tuer les ferments qui existent dans les végétaux et qui pourraient, sans cette précaution, hydrolyser ultérieurement les sucres et les glucosides. C’est dans un alcool de titre voisin de 60° que cette destruction se fait le mieux (1), et on arrive ici précisément à ce titre, l’eau contenue dans les tissus végétaux diluant l’alcoo!l à 90:.

L'addition de carbonate de calcium est nécessaire pour saturer les acides organiques qui pourraient amener le dédoublement de certains principes glucosidiques ou sucrés.

En faisant tomber les fragments dans l'alcool bouillant, on a soin de ne pas interrompre l’ébullition du liquide. Quand cette opération est terminée, on relie le ballon à un réfrigérant à reflux et on continue l’ébullition pendant 20 minutes. On laisse alors refroidir ; après refroidissement, on broie la plante et on lui fait subir un deuxième traitement à l’alcool bouillant, de façon à l’épuiser complètement.

On exprime à la presse, on filtre et on distille l'alcool au bain-marie.

Le résidu aqueux est filtré après refroidissement, et

distillé à sec, sous pression réduite. On reprend l'extrait, à chaud, par de l’eau thymolée, on laisse refroidir et on filtre. On complète alors le volume avec de l’eau thymolée de façon que 100 cm* de liquide obtenu correspondent à 100 grammes du végétal essayé.

On défèque 20 cm? du liquide au sous-acétate de plomb;

(1) Em. BourQuELOT et M. BRIDEL. — Sur la température de destruction de l’émulsine dans des alcools de différents titres. (Journ. de Pharm. el de Chim., (7), VII, p. 27, 1913).

Sur la résistance, à l’action de la chaleur, de l'émulsine en contact avec les alcools forts. (Zbid., (7), VIX, p. 65, 1913).

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on en fait l’examen polarimétrique et on y dose le sucre réducteur.

Au reste du liquide, on ajoute de l’invertine dans la proportion de 0 gr.,50 pour 100 emÿ et on porte à l’étuve à + 30°-35°. On fait tous les jours, après défécation de 20 cm au sous-acétate de plomb, l’examen polarimétrique et le dosage du sucre réducteur. Quand on a obtenu, deux jours de suite, les mêmes chiffres, ce qui arrive généralement en 3 ou 4 jours, l’action du ferment est terminée.

La plante contient-elle du saccharose ou un autre sucre renfermant du lévulose uni au glucose, on constate un recul de la déviation vers la gauche et une augmentation de sucre réducteur.

Si le sucre hydrolysé est du saccharose, les changements optiques observés coïncident avec ceux qu’indique le calcul en considérant le sucre réducteur formé comme étant du sucre interverti.

On peut encore reconnaître si le sucre hydrolysé est du saccharose de la façon suivante :

Avec le recul de la déviation observé sous l’action de l’invertine et le sucre réducteur formé, on calcule à combien de sucre réducteur pour 100 em? correspond un recul de 1° (1= 2). C’est l'indice de réduction enzymolytique, préconisé par M. BOURQUELOT pour la diagnose des glucosides, comme on le verra tout à l’heure. L'indice de réduction du saccharose étant 603, si on trouve par:le calcul un chiffre voisin de cette valeur, c’est que le sucre hydrolysé est vraisemblablement du saccharose.

. Après avoir ainsi constaté que l’action de linvertine est terminée, on porte le liquide au bain-marie bouillant, en vase clos, pendant 20 minutes, afin de détruire l’invertine. On retire alors le flacon du bain-marie, et on ajoute, après refroidissement, de l’émulsine dans la proportion de O0 gr.,25 pour 100 cm* ; on replace le flacon à l’étuve.

Les jours suivants, on renouvelle, après défécation

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préalable, l'examen du liquide au polarimètre et le dosage du sucre réducteur. Si on constate un retour de la déviation vers la droite, en même temps qu'une ‘augmentation de sucre réducteur, on peut conclure à la présence d’un glucoside lévogyre dérivé du glucose-d. Ce retour est généralement rapide, et l’action de l’émulsine est terminée en 5 ou 6 jours. Cependant, elle peut être retardée pour diverses causes, et j’ai vu des essais à l’émulsine se prolonger pendant près de deux mois ; dans ce cas, il faut alors ajouter de temps en temps 0 gr.,25 d’émulsine au liquide.

Si la plante essayée contient un sucre comme le raflinose, le stachyose, le verbascose, qui renferment du saccharose combiné et ont été, à cause de cela, partiellement hydrolysés par l’invertine, on constate, sous l’action de l’émulsine, un recul de la déviation vers la gauche au lieu d’un retour vers la droite. Ce recul est dû à l’hydrolyse des polysaccharides nouveaux mis en liberté par Pinvertine : mélibiose, etc..., hydrolyse produite par les ferments spéciaux que l’on rencontre dans l’émulsine des amandes.

Si la plante contient en même temps qu'un de ces sucres un glucoside dédoublable par l’émulsine, le sucre n'étant hydrolysé que très lentement, on constate d’abord un retour de la déviation vers la droite (hydrolyse du glucoside), puis un recul de la déviation vers la gauche (hydrolyse du sucre). On conçoit même que, dans certains cas, le recul et le retour puissent arriver à se compenser : alors, on ne constatera pas de changement de déviation, tandis qu'il y aura augmentation de sucre réducteur. Nous avons rencontré ce cas tout à fait spécial, M. BouURQUELOT etmoi, en étudiant la graine d’Entada scandens Benth. (1).

(1) Em. BourquELor et M. Briper. — Sur là recherche du raffinose dans les végétaux. Sa présence dans deux graines de Légumineuses :

Erythrina fusca Lour. et Entada scandens Benth. (Journ. de Pharm. et de Chim.,(6), XXX, p. 162, 1909).

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