TECHNIQUE, MÉTHODES ET APPAREILS

Nous avons constamment utilisé pour nos recherches la méthode des cultures pures en milieux stérilisés. Ces cultures étaient effectuées dans des matras spéciaux à longs cols d’une capacité de 125 centimètres cubes, et remplis seulement jusqu’à la moitié de leur panse. La longueur du col avait pour but d'éviter les contaminations, qui n’eussent pas manqué de se produire si le liquide agité était venu au contact du tampon d’ouate fermant le ballon bien que ce tampon fût lui-même recouvert d’une capsule d’étain.

Nous avons fait souvent usage, pour suivre la germination, des spores, chlamydospores, kystes, etc... ou le développement des Mucédinées, des cultures en cellules de Vax Tiezcnem. Les bagues de ces cellules étaient scellées sur le porte-objet au moyen d’un vernis spécial, ou plus simplement à l’aide d’un peu de vaseline. Les différentes parties de l'appareil étaient flambées avant le semis, et la lame appliquée solidement sur la bague au moyen d’un peu de paraffine.

Au début, lorsque nos cultures étaient mêlées d’autres microorganismes, nous isolions l'espèce qui nous intéressait soit par la méthode des stries successives, soit en émulsionnant dans de l’eau distillée une petite quantité

de spores, et répandant quelques gouttes de ce liquide sur des rondelles de carotte contenues dans des boîtes de Pétri. Nous obtenions par ce dernier procédé un isolement parfait des différents germes. Les échantillons dont nous sommes partis appartenaient aux Oomycètes, aux Ascomycètes et aux Mucédinées. (Voir Tableau des espèces soumises à l’expérimentation.)

Nos semis étaient effectués sur les milieux suivants :

1° Milieux liquides : Liquide de Raulin normal.

2 Milieux solides : Raulin gélatiné ou gélosé à 5 °/,.

Les spores des champignons à expérimenter étaient semées : 1° dans des matras contenant chacun 60 grammes de liquide de Raulin normal; 2° dans des matras contenant chacun 60 grammes de Raulin gélatiné.

Pour chaque expérience les semis étaient faits en double, l’un des matras étant laissé au repos pour servir de témoin, l’autre était soumis à une agitation continuelle. Les deux séries étaient maintenues au voisinage l’une de l’autre à une température comprise entre 18 et 20°.

Nous avons employé le liquide de Raulin parce que ce milieu est de composition nettement définie, et qu'il est favorable à la culture de nombreuses espèces de champignons microscopiques. Pour compléter nos recherches, nous avons fait pour les milieux liquides au repos deux semis, l’un en surface, l’autre en profondeur. Cette double série nous a permis de nous rendre compte de l’influence de la seule immersion sur la forme des éléments mycéliens.

L'agitation favorise la contamination des cultures malgré toutes les précautions prises. Pour éviter les erreurs de ce chef, nous avons procédé à un examen microscopique minutieux, à la fin de chaque expérience ; puis nous avons ensemencé les milieux solides et liquides les plus divers avec le contenu de chaque culture agitée.

Dans le cas d’une culture demeurée pure, nous obtenions toujours, au bout d’un temps plus ou moins long, l'organisme dont nous étions partis, et lui seul ; dans le cas

contraire, nos cultures étaient accompagnées de diverses impuretés, surtout de Penicillium, d'Aspergillus, ete...

Toute expérience dans laquelle une contamination avait apparu était considérée comme nulle.

Il était absolument nécessaire de suivre cette technique rigoureuse, car nous verrons plus tard combien l’agitation est susceptible de modifier l'appareil végétatif et les appareils reproducteurs des Mucédinées. Pour être sûr d’avoir affaire toujours au même organisme, il était indispensable que l’expérimentateur s’entourât de tous les moyens de contrôle révélés par le raisonnement et la pratique.

Nos premières expériences d’agitation terminées, nous faisions pour chacune d'elles deux parts d’une culture en milieu liquide restée au repos; l’une des moitiés était soumise à l'agitation, l’autre servait de témoin. Inversement, nos cultures agitées étaient ensuite remises au repos pendant un certain temps.

Nous avons procédé ainsi, pendant plus d’une année, à un très grand nombre d'expériences, les unes d’une durée de quinze à vingt jours, les autres variant entre un, deux et trois mois. Chaque plante était examinée aux divers stades de développement.

Dispositifs employés pour déterminer l'agitation de nos cultures.

L'appareil ayant servi à agiter nos cultures se compose d'un socle de bois solidement vissé sur une table, et supportant un pied métallique, le long duquel peut se fixer à diverses hauteurs, à l’aide d’un collier de serrage, une tige cylindrique horizontale formant potence. Cette tige sert de suspension, par l'intermédiaire de deux bandes de laiton verticales et parallèles à un plateau porteobjet (PI. I).

Ce plateau, qui au repos est horizontal, est percé de

séries concentriques de trous, recevant des chevilles de bois entre lesquelles on cale les récipients de différentes dimensions. Ce procédé de fixation très simple nous a toujours donné d’excellents résultats.

Sous le disque porte-objet est fixé un crochet pouvant ètre attaché à une bielle actionnée par un moteur à eau.

Ce moteur peut faire 120 tours à la minute avec une force d'environ un dixième de cheval-vapeur.

Le mouvement de va-et-vient est communiqué à la bielle par un excentrique à diamètre variable, qui recoit le mouvement du moteur par l'intermédiaire d’un arbre à transmission démultipliante.

Pour régulariser l'agitation et donner de la souplesse au mouvement, la bielle est constituée par un ressort à boudin. Un ressort de rappel en caoutchouc, exerçant sa traction en sens inverse de la bielle, permet au système oscillant d’obéir instantanément aux impulsions recues du moteur.

Afin de pouvoir substituer aux matras de simples tubes à essai, une série detiges de laiton, garnies de bracelets de caoutchouc, permettait de fixer ces tubes dans la position verticale.

La période des oscillations était mesurée à l’aide d’un métronome.

Appareil destiné à annuler l’action de la pesanteur.

Pour annuler cette action, je me suis servi de l’appareil suivant construit par mon père. (PI. IL.)

Une roue verticale pleine en bois recoit son mouvement du moteur, sur la poulie duquel est fixé un tore de caoutchouc frottant directement sur le bord de la roue, qu'il entraine dans son mouvement. (PI. IL, fig. r.)

Les matras à cultures sont fixés suivant les diamètres de cette roue par un dispositif fort simple.

IL se compose d’une bande métallique pliée à angle droit à sa partie inférieure sur une longueur déterminée.

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Sur cette partie pliée est placé un plateau de bois garni de trous permettant d'employer notre système de chevilles nécessaires à la fixation des ballons. La partie supérieure de la bande métallique est munie d’un axe cylindrique pouvant s'engager exactement dans un orifice placé en dehors du centre de la roue et fixé solidement au moyen d'un écrou.

Au début de nos expériences, nous employions, pour éviter la chute de nos ballons pendant le mouvement circulaire, trois chevilles de laiton recouvertes de caoutchouc (PI. IT, fig. 3); la partie inférieure était rodée, la partie supérieure était pliée à angle droit. L'extrémité coudée recevait perpendiculairement une petite pièce légèrement convexe formant un tiers de circonférence. Les parties rodées étaient vissées dans le plateau porteobjet; les petites combinaisons ménagées aux extrémités coudées permettaient, par la réunion de trois de ces chevilles, de constituer un anneau s’emboitant sur le goulot du matras et pouvant se serrer à volonté au moyen d’une ficelle.

Nous avons, par la suite, simplifié ce dispositif en fixant chaque ballon à l’aide d’un collier métallique passé à la naissance de son col et fixé à la roue par deux tirants à écrou2 (PEU, fps)

Pour chacune de ces expériences un matras-témoin demeurait fixe, un autre était soumis à l'agitation.

Ces différents appareils ont été construits et réglés par nous en suivant les conseils de notre père et de nos maîtres, MM. les professeurs RaDaïs et GUEGUEN.

Examen des cultures. — Nous avons examiné les cultures dans toutes leurs parties, tant dans leur aspect macroscopique qu’au point de vue histologique.

Enfin, nous avons signalé au passage quelques faits biologiques qui nous ont paru intéressants.

Technique histologique. — Il était nécessaire, pour l'examen microscopique deces mucédinées, d’avoir recours

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à une technique qui ne déformât pas ces plantes extrèmement fragiles.

Fixation. — Les agents de fixation dont nous avons fait usage sont: la chaleur, l'alcool, le liquide de Flemming, l'acide picrique à saturation, le picroformol, le sublimé acétique; l'alcool à 90° et l'acide picrique nous ont donné les meilleurs résultats.

Méthode des coupes. — L'examen des cultures au repos n'offrait aucune difficulté ; il suffisait de les fixer, d'en prélever une parcelle, de les traiter par un colorant approprié.

Il n’en était pas de même pour la plupart des cultures agitées et notamment pour celles qui consistaient en boules que nous étudierons plus loin.

Dans ce dernier cas, deux méthodes étaient employées par nous pour l'observation microscopique :

1° L'inclusion en paraffine;

2° La dissociation à l'aiguille, suivie parfois de l’écrasement modéré à l’aide d’un compresseur à vis.

1° Dans le premier cas, les sphères mycéliennes étaient traitées successivement par l'alcool à 30°, 40°, 50°, Go’, 80°, 90° et alcool absolu, puis plongées dans le xylol et incluses dans la paraffine. Le bloc ainsi obtenu était placé sur le microtome. Les coupes en série étaient colorées par les procédés que nous indiquons plus loin.

2° La dissociation était relativement facile et se faisait sur des coupes radiales au moyen de fines aiguilles. On complétait la séparation des éléments au moyen de légers chocs sur le couvre-objet.

Colorants. — Pour étudier les formes extérieures, les colorants que nous avons le plus fréquemment employés sont le bleu lactique, le rouge Congo et le violet de genliane.

Une méthode excellente est celle indiquée par Ray. Après un séjour de 24 heures dans l'alcool, un fragment de

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culture est placé pendant une demi-heure environ dans une solution de violet de gentiane additionné de quelques gouttes d'alcool à 90°.

« La teinture se prépare dans un verre de montre, elle doit être très étendue ; il faut qu'on puisse apercevoir un objet placé sous le verre. »

Ce traitement suffit pour étudier la forme extérieure et le cloisonnement; le contenu des articles se trouve coloré en masse.

Nous ne saurions trop recommander ici le colorant triple de GUEGUEN (1), à base de Sudan III, iode et bleu lactique, qui permet de déceler à la fois le glycogène ou l'amidon, teinte le protoplasme en bleu, et colore les globules de graisse en rouge.

L’acide osmique est également un excellent réactif des graisses, nous l'avons employé concurremment avec le colorant triple.

Les corpuscules métachromatiques étaient reconnus en nous servant d’une solution de bleu de méthylène à 1 p.100. Le protoplasme se colore en bleu clair et les corpuscules métachromatiques prennent une teinte variant du bleu intense légèrement violet au rouge vif.

Le procédé qui nous a donné les plus belles préparations pour le noyau est celui indiqué par GUILLIERMOND (2). C’est l'hématoxyline au fer de HEtDENHAIM. Il consiste à mordancer pendant un temps variant de 4 à 6 heures dans une solution de fer ammoniacal à 2 1/2 p. 100. On lave à grande eau et on colore pendant »4 heures dans une solution d’hématoxyline à 1 p. 100. On décolore dans la solution d’alun de fer. Pour avoir une netteté encore plus grande, il est facile de colorer le protoplasme avec l’éosine.

(1) Guecuex (F.). Emploi du Sudan III comme colorant mycologique seul ou combiné au bleu coton et à l’iode (Bull. Soc. mycol., t. XXII, p. 224, 1906).

(2) GUILLIERMOND. Études cytologiques sur différents champignons inférieurs. Thèse doctorat ès sciences, 1900.

Conservation des préparations. — Nous nous sommes très bien trouvé de la glycérine aqueuse; toutefois on ne peut conserver longtemps ces préparations. Les sphères mycéliennes résultant de l’agitation se conservent très bien dans de l’eau formolée à 1 p. 100.

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