NE TR

Dans ces conditions nous opérerons de la façon suivante :

1°) Nous mesurerons l'absorption directement, puis à titre de contrôle |

2°) Nous mesurerons l’absorption après une dilution convenable puis

3°) Nous rechercherons la concentration en caro-

tène comme il a été dit.

Il suffira alors de retrancher du taux global trouvé. le taux de bilirubine correspondant absorptiométri-

quement au carotène.

ESSAI DE DISTINCTION DES BILIRUPBINES DIRECTE ET IN- DIRECTE. (11) (10) (12)

1 — Par colorimétrie directe du sérum sanguin nous avons dosé la totalité de la bilirubine : directe et indirecte, mais nous n’avons qu’une idée très peu pré-

cise du rapport qui existe entre les deux.

2 — La méthode de VAN DEN BERGH telle que

nous l’employions était longue, fastidieuse et, de plus,

‘ sa précision n’était pas très grande.

Nous avons Le d’adapter le procédé des américains MALLOY et KENNETH A. EVELYN (13) qui recherchent le taux de bilirubine indirecte sans précipitation, par diazotation et comparent colorimétrique-

ment le tube diazoté à un témoin.

Technique : on fait un tube témoin qui contient : 5 cc. d’alcool méthylique absolu

1 cc. d’HCI au 1/4

4 cc. de sérum dilué 10 fois

L'autre tube contient : :

5 cc. d’alcool méthylique absolu 1 cc. de Diazo-réactif

4 ce. de sérum dilué 10 fois.

L’avantage de cette méthode est d’éviter l’erreur dûe à la perte d’une partie de la bilirubine par fixation sur le précipité d’albumines; en effet cette technique évite toute précipitation. De plus, ces auteurs ont montré que l’on pouvait dans ces conditions doser la bilirubine indirecte contrairement à ce qu'avait pensé VAN DEN BERGH. |

Ainsi nous avons deux tubes bien comparables; , la seule différence est que le premier est coloré par la bilirubine (et par le carotène s’il y en a en quantité appréciable) tandis que le deuxième est coloré par l’azobilirubine provenant de sa transformation (et par le carotène également). Dans ces conditions le carotène n'intervient pas puisqu'il existe également dans les deux tubes que l’on aura à comparer. On règle lPabsorptiomètre au zéro avec le premier tube qui est donc ainsi utilisé comme base colorimétrique. A chaque concentration en bilirubine connue par un étalon-

nage précédent correspond une absorption particulière

ne nn.

et l’azobilirubine provénant de la transformation de la bilirubine entraîne une absorption qui est fonction de sa concentration. On a dressé une courbe d’étalonnage des absorptions (des solutions diazotées par rapport aux solutions témoin) en fonction des concentrations en bilirubine. On a opéré en lumière verte c’est-

à-dire dans la région du maximum d’absorption de la

diazobilirubine.

On a choisi un certain nombre de sérums parmi ceux que l’on a examinés et on a réuni dans le tableau

suivant les résultats obtenus pour les concentrations :

1°) Par notre méthode habituelle de dosage de la à bilirubine indirecte à la sphère d'intégration en lu-

mière bleue.

2°) Par la méthode d’'EvELYN, MALLoY. ete.

3°) Nous avons noté enfin les absorptions des sérums diazotés par rapport aux témoins, mesurées à Ja sphère d'intégration en lumière verte également; pour cette dernière colonne on voit que la sensibilité de la sphère n’est pas suffisante et qu'il faudrait reprendre ces expériences avec un dispositif plus sensible puisque nous avons vu que c’est le seul moyen que nous

ayons de faire de la colorimétrie correctement.

Concentration déterm. ‘Par la méth.

Sérum par colorimétrie dir. d'EVELYN à Absorpt. par

N° par le comparateur à lPabsorpt. la sphère en

à sphère en ium. bleue en lum. verte lum. verte

1 +10 +7 “1,5 2 5 LR 51 6,5 3 16 16 25 4 60 57,5 7 *5 * 64 38 75

Nous avons constaté que si la méthode évite la précipitation des protéines il n’en est pas moins vrai qu’il existe souvent une turbidité prononcée et qui n’est pas nécessairement la même dans les deux échantillons. On voit que les résultats coïncident souvent mais il est aussi des cas où ils ne coïncident pas du tout (*) et l’erreur de diffusion ne semble pas suffisante pour expliquer de tels écarts. Ceux-ci sont vraisemblablement dûs à la présence de hilirubine directe en ‘grande quantité; le fait que nous trouvons des

chiffres supérieurs permet de faire cette supposition.

3 — Pour la recherche de la bilirubine directe, MazLoy et EvELYN (13) se servent de la réaction recommandée par VAN DEN BERGH et dont voici la technique :

À 1 ce. de sérum on ajoute 2 ce. de Diazoréactif.

On laisse 15 minutes à l’abri de l’air.

On ajoute 2 ec. d’eau distillée puis une solution J P

alcoolique tampon jusqu’à 10 ce.

On attend 15 minutes avant de lire le résultat.

On compare comme dans le cas précédent au tube

témoin et on se reporte à la courbe d'étalonnage.

La question du dosage des deux bilirubines dans le sérum semble pouvoir être résolue par l’étude ciné-

tique de la réaction de diazotation.

VAN DEN BERG (10) a imaginé de se servir d’un

colorimètre type Dubosq.

À droite, on a du Diazoréactif (viré au rose) dns une grande cuve B dans laquelle on peut faire plonger plus ou moins profondément une petite cuve À de sérum pur.

À gauche, on a du sérum auquel on ajoute le diazoréactif. Au moment où l’on ajoute le diazoréactif le

sérum est jaune.

À droite, la cuve À étant au fond de la cuve B. l'œil ne voit que le sérum jaune, on note la hauteur de la cuve À : 0.

Puis à gauche le sérum vire au rose par diazotation, il faut alors relever la cuve À pour que l'œil percoive la couleur rose. On note régulièrement la hauteur dont il faut élever la cuve À pour conserver l’égalité de teinte des deux côtés. On établit une courbe

des hauteurs en fonction des temps notés :

1) Pour les sérums à réaction directe, le sérum vire très rapidement au rose ce qui se traduit par une courbe très rapidement ascendante; ensuite on ne note plus d'augmentation sensible et cela se traduit par un

plateau.

2) Pour les sérums à réaction indirecte, au contraire, on doit attendre plus ou moins longtemps avant de voir la couleur du sérum virer au rose: cela se traduit par une courbe confondue avec l’axe des abscisses, puis le virage se produit lentement et la courbe

devient lentement ascendante.

HARTOG, avec VAN DEN BERGH (14), a montré que les réactions représentées par ces graphiques de vitesse sont du type monomoléculaire et il en résulte que si on porte les logarithmes des valeurs obtenues en ordonnées, on obtient des droites; l’angle qu’elles forment avec l’axe des ordonnées mesure alors la vitesse

de réaction.

Pour les sérums contenant un mélange des deux bilirubines on a une ligne brisée et si À est le point de rencontre avec l’axe des ordonnées, B le point de brisure et D le point de rencontre du prolongement de la deuxième partie B C de la ligne brisée avec l’axe des ordonnées :

oAÀ donne la concentration en bilirubine directe.

D donne la concentration en bilirubine indirecte.

PRET Se NS

oÂÀ AT me ? le rapport des deux, est intéressant aussi à con-

sidérer en clinique

Nous pourrions adapter cette méthode à nos appareils de mesures : absorptiomètre et, mieux encore colorimètre à sphère qui permettraient de faire une étude cinétique dans de bonnes conditions. Il suffirait d’ajouter le diazoréactif au sérum et de régler à ce moment l’appareil au zéro puis de suivre à intervalles réguliers les variations de l’absorption.

Les dispositifs photoélectriques rendant très facile l’étude précise de la cinétique des réactions colorées, il serait intéressant de les adapter à la méthode précédente. En outre comme nous l’avons déjà fait remarquer, il est possible qu’il existe une différence de teinte entre la bilirubine directe et la bilirubine indirecte qui pourrait alors être révélée par une mé-

thode spectrométrique précise.