Préparation de la suspension d’hématies
Nous avons adopté, pour la préparation d’une suspension standard d’hématies, la technique de CozLrer et coll. (1952) ;
Hématies de mouton conservées à 4° en solution d'ALSEVER ; centrifuger à 3.000 tours (centrifugeuse horizontale) pendant 10 minutes et laver 3 fois dans la solution TV. ; décanter et faire une suspension à 10 %. Prélever 4 ml. de cette suspension et les porter ‘ dans un tube à hématocrite. Centrifuger 15 minutes à 5.000 tours. Calculer le pourcentage réel de la suspension d’après le culot obtenu pour 4 ml. Ajouter à la suspension à 10 % du tampon véronal pour obtenir une suspension à 2 % en utilisant la formule :
2% Vx— — V = X
où V : volume de la suspension à 10 % à laquelle on rajoutera X de solution T.V.
Titrage de l'activité du complément en présence d'antigène :
Son but est de déterminer la dose de complément qui permet l'hémolyse totale d’une quantité fixe d’hématies en présence des deux antigènes A et B utilisés dans la réaction. On place sur un portoir ordinaire les 13 dilutions de complément précédemment préparées et on dispose, sur deux portoirs spéciaux, 15 tubes spéciaux pour chaque antigène placés en regard des dilutions homologues. On reporte chaque dilution de complément dans les deux tubes homologues, sous un volume uniforme de 1 goutte, à la pipette compte-goutte spéciale. On obtient ainsi deux galeries de 15 tubes chacune contenant les 15 dilutions croissantes du complément. Il faut prendre soin de commencer la répartition par les dilutions les plus élevées.
On ajoute ensuite dans une galerie l’antigène A, dans l’autre l'antigène B, à raison de 1 goutte dans tous les tubes sous une dilution uniforme déterminée préalablement par un titrage effectué suivant la méthode de Borrner-Luxens (voir plus loin, p. 49).
On ajoute enfin dans tous les tubes 1 goutte de solution tampon-véronal.
On agite et on porte au bain-marie pour une heure. On ajoute alors dans tous les tubes IT gouttes d'un mélange à parties égales de la suspension d’hématies à 2 % du culot et d'une solution de sérum hémolytique contenant 4 doses minima hémolytiques (voir plus loin, p. 49).
On reporte alors au bain-marie à 37° pour une heure, mais on fait une première lecture après une demi-heure et une deuxième après une heure, à titre de contrôle.
AMEL
Au total, les opérations sont les suivantes :
Pour chaque dilution du complément :
GT goutte
Ag | goutte;
TN L'ponttes, à
Une heure au bain-marie à 37°.
Hématies sensibilisées : II gouttes.
Une heure au bain-marie à 37°.
L'unité de complément est donné par la dilution la plus élevée qui provoque l’hémolyse totale après une heure. Pour la réaction, on utilise 2 unités sous le volume de 1 goutte, c’est-à-dire qu'on
emploie une dilution égale à la moitié de celle qui a provoqué l'hémolyse totale.
Il. — REACTION.
Préparation des réactifs :
1. - Dilutlion des sérums à experliser et des sérums de référence : Elle est faite au rhéomètre de VERNES, à partir d'une dilution initiale du 1/8 faite à la pipette (sérum pur : 0,1 - T.V.: 0,7 ml.). On prépare ainsi des dilutions en progression géométrique de raison 2 allant du 1/8 au 1/1.024.
2.- Antigène : Il est dilué de telle sorte qu’il contienne 2 unités, soit la concentration double de la solution la plus élevée qui, dans le titrage précédemment effectué par la méthode du damier de Bogrner-Lukens, à porté à son maximum le titre d’un sérum de référence connu (voir p. 49).
3. - Complément : On fera une dilution de telle sorte qu’une goutte contienne 2 unités (soit 2 fois plus concentré que la dilution qui à permis l’hémolyse totale lors du titrage du jour).
4. - Système hémolytique : Le même que celui utilisé pour le titrage du complément.
Répartition des réactifs :
Pendant que se poursuit le titrage du complément, on prépare les dilutions des sérums et on les reporte, à raison de 1 goutte, dans autant de tubes spéciaux en commençant pour chaque sérum par la répartition de la dilution la plus élevée; en outre, on prévoit, pour chaque sérum, deux tubes dits «témoins sérum » où l’on reporte les dilutions au 1/8 et au 1/16 (recherche du pouvoir anticomplémentaire du sérum).
RE VAPae
On répartit ensuite l'antigène, à raison d’une goutte, dans tous les tubes sauf les deux témoins, et enfin le complément, à raison d'une goutte dans tous les tubes y compris les témoins-sérums. On complète le volume des tubes témoins-sérum à trois gouttes en ajoutant une goutte de T.V.
Outre les témoins propres à chaque sérum, il faut prévoir des témoins dits « généraux », destinés à contrôler que le système hémolytique ne varie pas, que le complément est bien présent à deux unités à la fin de la réaction, enfin que l’antigène n’a pas de pouvoir anticomplémentaire ni de pouvoir hémolytique. La mise en place de ces témoins généraux est représentée dans le tableau cidessous (voir p. 48).
Il faut noter que les témoins généraux exigent, outre du complément à 2 unités, du complément contenant 1 et 1/2 unité ce qui oblige à préparer une petite quantité de complément à des dilutions égales à la moitié et au quart de celle utilisée dans l’ensemble de la réaction.
Lorsque sont répartis les dilutions de sérum, l’antigène, le complément et le T.V., on agite les portoirs et on les porte au bainmarie à 37° pour une fixation d'une heure. On ajoute alors dans tous les tubes, IT gouttes de la suspension d’hématies sensibilisées : les quantités de réactifs et l’ensemble des opérations sont indiqués dans le tableau ci-dessous.
Dans nos tableaux, les abréviations ont la signification suivan- 1e ;
Ag : antigène - C’ : complément - T.V. : tampon véronal - G.R, Sens : hématies sensibilisées - A +C’ : Témoin vérifiant le pouvoir du complément en présence de l’antigène - C.H. : témoin vérifiant le pouvoir du complément sur le couple hémolytique en l'absence d’'antigène - À — C’ : témoin vérifiant que l’antigène n’a pas de pouvoir hémolysant en l'absence de complément - T.H. : témoin hématies vérifiant que les hématies n’hémolysent pas spontanément.
