I. — RÉSUMÉ DE LA THÉORIE DU POINT ISOÉLECTRIQUE

L'expérience montre que la méthode fondamentale pour la détermination du peint isoélectrique, là cataphorèse, se présente au premier abord, dans les systèmes biologiques, avec des particularités qui demandent une révision préalable de la théorie du point isoélectrique : c’est ainsi qu’une cataphorèse de sérum dans l'échelle des pH montre, par exemple, plusieurs points de ansport nul ou Symétrique, dont quelques-uns ont des caractères aberrants par rapport aux propriétés usuelles des points isoélectriques.

Me 22

Nous avons donné à cet effet (VLÈS (3) 1924) une révision de la théorie des ampholytes dans le cas où le système examiné est un mélange de plusieurs constituants, et qu’ils sont susceptibles de s’unir en complexes, comme cela doit être le fait dans le cas des substances protéiques ; nous avons montré que ces complexes d’ampholytes sont eux-mêmes des ampholytes ayant un point 150électrique particulier, avec l’ensemble des propriétés physicochimiques dévolues à de pareils points (minimum de solubilité) ; mais ces complexes ne doivent avoir qu’un domaine de cohérence et d’existence limité dans l’échelle des pH, et s'égrènent en leurs constituants si on les écarte trop de la zone d'intervalle des points isoélectriques de ceux-ci. La cataphorèse d’un système d’ampholytes doit donc mettre en évidence dans l'échelle des pH toute une série de points isoélectriques expérimentaux, dont les uns appartiennent aux constituants, et les autres à des complexes de ceux-ci dépendants du pH du système; d'autre part, entre ces points isoélectriques, il doit exister des pornts neutres de seconde espèce, sorte de faux points isoélectriques, dont la théorie peut rendre compte. Tout récemment, le même problème des complexes d’ampholytes a été repris par STEARN (11) (1926-1027) qui, sans connaître nos résultats, en a retrouvé un certain nombre.

10 Point 1soélectrique d'un ampholyte monovalent. — Rappelons que le point isoélectrique d’un ampholyte possédant une valence acide et une valence alcaline (ce que nous appellerons l’ampholyte monovalent) est lié aux constantes de dissociation pK de ses valences terminales ; si l’on compte celles-ci (aussi bien l’acide que l’alcaline) d’une façon uniforme dans la notation en pH, le point isoélectrique pH; est:

pH, = (pK, + pK).

20 Points 1soélectriques d'un ampholyte polyvalent. — Lorsque

l’ampholyte devient polyvalent (par exemple une valence alcaline et deux valences acides) le phénomène se complique, en ce qu'il peut y avoir pour les points isoélectriques plusieurs valeurs possibles qui ne sont pas nécessairement confondues. Par exemple dans le cas ci-dessus l’une des valeurs est relative à la dissociation simultanée des deux valences acides a, et a, pour laquelle on a:

PH = 7 (PKa + PK + pK) l'autre est relative à la dissociation d’une seule valence acide, et est du type:

Be PH = 2 (PK ua PK).

En somme on a d’une façon générale pour l’ampholyte polyvalent : ù

pH, = —

dans lequel # représente la totalité des valences acides ou alcalines, actuellement dissociées, et ZpK la somme de leurs constantes respectives. On voit donc qu’un ampholyte polyvalent, le long de l'échelle des pH où la totalité de ses valences ne sera pas toujours simultanément opérante, pourra présenter autant de points isoélectriques qu’il y aura(n —-1) valences.

3° Mélanges. — Un mélange de deux ampholytes A et B pourra, en fonction du pH, donner lieu à la formation de complexes, toutes les fois qu'ils seront dans une zone de pH où l’un pourra fonctionner comme anion et l’autre comme cation, c’est-à-dire principalement 1 dans la zone qui sépare les points isoélectriques des deux corps (fig. 4) ; il est facile de voir que ces complexes seront eux-mêmes des ampholytes et auront à leur tour des points isoélectriques particuliers, où ils jouiront des propriétés spéciales appartenant à de tels points (en particulier le minimum de solubilité). Lorsqu'il se trouve mélangé un nombre quelconque d’ampholytes, il est possible que les complexes primaires formés entre ces constituants du fait qu'ils sont eux-mêmes ampholytes, forment entre eux des complexes de complexes, lesquels peuvent aller, si les conditions de bH le permettent, jusqu’à la constitution d’un complexe global (fig. 4) de point isoélectrique résultant total.

1 La transformation des ampholytes d’anions en cations aux points isoélectriques ne se fait totalement que dans le cas, usuel pour les protides, où les degrés, de dissociation « de ces ampholytes sont pratiquement nuls à ces points. Mais si « n’est pas nul, il y à au delà des points isoélectriques une certaine marge (dont l'étendue dépend précisément de «), où des molécules présentent encore les propriétés nécessaires à une combinaison : on aura affaire à un équilibre statistique, où existeront des restes de molécules-anions dans la zone des cations et réciproquement ; le point critique de la transformation totale sera en réalité donné par le moment où le degré de dissociation de la valence inté essante sera nul ou négligeable.

Le point isoélectrique d’un complexe peut être calculé aux dépens des points isoélectriques des constituants et de leurs pK; par exemple, pour le cas de deux ampholytes monovalents :

Re:

pH, = ZDHI PRE Do) (pKa étant relatif à la valence acide du constituant de pHi le plus bas, et pKb à la valence alcaline du constituant anion, de pHi le plus élevé ; c’est-à-dire les deux valences intéressées par ia jonction immédiate des radicaux).

F1G. 4. — En haut: charge électrique E de deux ampholytes A et B mélangés, lorsque le pH varie. pH; À, pH; B, points isoélectriques de A et B; Z, zone de pH où A et B, de charges inverses, peuvent s'associer en complexes (VLÈS).

En bas : association en complexes, dans l'échelle des pH, d’ampholytes de points isoélectriques P,, P,, ... en complexes d'ordre divers de points isoélectriques P,;, P,-5, P;-3-1-6... (VLÈS).

Nous avons étendu le problème à celui d’un complexe entre un ampholyte divalent et deux monovalents («sel neutre ») ; enfin en généralisant on aboutit à une formule d’un mélange d'ampholytes en nombre quelconque :

pHi, = = (Z tm. pH, - ZEm’.pK,.) S

m étant le nombre total des valences, acides et alcalines, libérées ou non, d’un constituant ; #’ étant le nombre des valences d’un constituant engagées dans le complexe, et possédant des constantes pKm ; t le nombre de molécules d’un constituant entrant dans le complexe ; s le total des valences des divers constituants restés libres, c'est-à-dire non engagées dans le FHRDICe et actuellement fonctionnelles.

Un exemple expérimental a été réalisé au moyen de perse d'acide aspartique M /20 et de glycocolle 1,6 M portés à des pH divers ; on a recherché les complexes réalisés par leur minimum de solubilité (précipité en présence d’acétone-éther).

Les constantes de calcul sont :

Poids pKa. pKb. ‘pi moléc.

VE 2,2 5,36 (divalent) A:10,4 2,85 (monovalent) glycocolle 76 0,64:,-2,38 5,98

Le calcul! des complexes donne un certain nombre de combinaisons ampholytes possibles (mais dont plusieurs peuvent ne pas exister dans les conditions réelles, et n’être que virtuelles (fig. 5) :

pHi

ac. aspartique 133

ac. aspartique monovalent, pH bas... 2,8 et 5,0

OHAH.GH 4 états de l’aspartate ; é ac. aspartique diva-

monoglycinique nt Eee ét élevés AR: 5,1 ét 7,4 OA) prcaspartate délvcinique 27e Le. TT à : monovalent ..... 2,9 OHG.AH 2 glycinates aspartiques DV Er ser 5,1 OHG.AH.GH 2 glycinates asparto-monoglyciniques .... - : OH.GA.(GH}? 1 glycinate asparto-diglycinique ............ AE

L'expérience fournit trois minima de solubilité, l’un vers pH3 (ac. aspartiques monodissociés), l’autre de 6,5 à 8, avec maximum vers 7,5 (vraisemblablement les aspartates monoglycinique,

1 Recalculé avec les nouvelles constantes de l’acide aspartique, postérieurement déterminés par E. VELLINGER. (Aych. phys. biol., vol. V, p. 45, 1926). Ces valeurs rectifient un erreur de chiffres qui s’est introduite dans une publication américaine antérieure.

‘21109098 op 39 onbrjredse oproe,p soxopdwuon — *S ‘SM

[Sels de Na]

Rare arpax te - AMC Re ne

antate Les Cycinra en Late age ique PES mpênto mono

(2 ate aspantique gour as are Ut rdiva bent Qêycinate 45 parLo eo géyuinique.

axtate monoqgéycinique

aspantate Monogéycinique.

Qcida capantiqgus monovaéent

PH

Combinaisons possibles

PHi

calcules

Solutions nealisées

Précipités

PTT

diglycinique, glycinates aspartoglyciniques), le troisième aux pH très élevés (212) (et qui doit être le jeu d’un produit ionique sur les sels de Na en présence de la forte concentration en NaOH).

49 Quantités de substance. — On peut substituer aux constantes pK, qu’il est quelquefois difficile de déterminer expérimentalement, des quantités de constituants et de constitués ; par exemple pour deux constituants monovalents :

pHi, = ZpHi - 7,07 + 1/2 là, n

(avec +, si #’, concentration du constituant de plus fort pHi, est la plus grande ; et — si #, concentration du constituant de plus faible pHi, est la plus grande ; q, % du complexe formé) ; d’une façon générale une chaîne de 7 ampholytes monovalents aura par exemple un pHi, résultant :

y pHi, = ZpHi - (r-1) ;,07-1/2 189) (ge étant un terme de quantités de substances).

5° Cohérence du complexe. — Il faut d’ailleurs remarquer que le complexe total ne peut être formé et cohérent qu’au voisinage immédiat du pHi résultant total ; en cas de variation du pH du milieu extérieur, il cesse d’être complètement cohérent, et Les éléments risquent de se détacher un à un réversiblement de la masse indivise à mesure que le pH dépasse le pHi d’un des constituants1 (fig. 4). Ceci est extrêmement important au point de vue biologique : le complexe d'ampholytes ne doit avoir, dans l'échelle des DH, qu’un domaine d'existence limité.

60 Cataphorèse des complexes d'ampholyies. — Il résulte des considérations précédentes qu’un mélange de deux ampholytes soumis à cataphorèse pourra présenter le long de l'échelle des pH, trois points isoélectriques apparents: deux qui correspondront aux constituants isolés du mélange, et un troisième qui correspondrait au complexe (que nous appellerons le diamphide) ; en général un mélange de m ampholytes pourra présenter un nombre plus grand que "» de points isoélectriques des constituants isolés, des pHi de complexes partiels de premier ordre, de deuxième, etc., et éventuellement un résultant général d’un complexe total, m-amphide. (fig. 4, en bas).

1 Voir note de la page 8.

Au point de vue de la charge électrique et de la cataphorèse, l'existence de points isoélectriques multiples donnerait lieu aux propriétés suivantes :

Soit un diamphide de constituants A et B, et de points isoélectriques pHi,, pHiz. Au voisinage de chaque point isoélectrique le composé qui lui est relatif est chargé + du côté des faibles pH et — du côté des forts pH. Le complexe diamphide pHiz va dans la zone pHiz -pHi, être de signe inverse du constituant À ; à mesure qu’on s'éloigne de pHis vers pHi,4 la quantité du complexe diamphide formé diminue : la valeur absolue du total des charges qu’il porte diminue donc également. Par contre la quantité du composant À isolé qui se libère du complexe augmente. Le mélange (complexe + composant A) existant à un pH intermédiaire aura donc d’abord des charges qui seront en majorité du signe du composant À seul, à son tour en excès. Les deux charges limites de la zone étant inverses, il y aura entre les deux un point où la cataphorèse effective du système sera en apparence pratiquement nulle (ou plus exactement très faible mais égale dans les deux sens: c’est la différence des déplacements apparents qui sera nulle).

Ce point, que nous appellerons le point neutre de seconde espèce, pHN ou pN, se comportera pratiquement comme un point isoélectrique, avec ceci de particulier que le système apparaîtra comme négatif du côté des pH plus bas que lui et comme positif du côté des forts pH: par conséquent la répartition des déplacements est inverse de celle qui conviendrait à un ampholyte des deux côtés de son vrai point isoélectrique. Si l’on regarde les choses de plus près, il est d’ailleurs évident que le système n’a pas la même composition des deux côtés de ce point neutre, alors que ce peut être le cas pour le point isoélectrique.

Il résulte de ceci, que si l’on envisage une échelle de pH suffsamment grande, un mélange de deux ampholytes aura des chances de présenter cng points de cataphorèse expérimentalement nulle : trois points isoélectriques vrais et deux points neutres de seconde espèce.

Si la cataphorèse, aux points neutres de seconde espèce, donne un résultat apparent simulant un point isoélectrique mais avec inversion de rapports, les autres procédés techniques, comme l’indice d'alcool, peuvent donner des résultats différents : il n’y a pas

nécessairement de minimum de solubilité ou de stabilité aux points neutres de seconde espèce comme il y en a aux points isoélectriques. Voici deux exemples montrant l’existence du point neutre de seconde espèce PN à côté du point isoélectrique pH.. 19 Purée de muscle de Souris (expérience n° 84, VLÈS et DE * CoULON, Souris injectée avec de l’édestine).

+ |: pH 5 6 7 8 9 10 —- 0% + 0x El +4 Qt << ®) + + l'o-x +

ppt chargé + A ppté chargé — A | ppté chargé + pH. PN

Un autre exemple peut être tiré de cataphorèses d’oxyhémo” globine cristallisée (O*Hb de première cristallisation, dans eau physiologique NaCL 9 %, de pH ajustés par HCI ou NaOH, ou dans des tampons Walpole acétates-acétiques). Le point 1soélectrique trouvé classiquement par les auteurs (MICHAELIS et TAKAHASHI, MICHAELIS et DAVIDSON) est pH 6,7. Mais avec une échelle de pH assez étendue on trouve un point neutre vers 10, et un autre vers 5,1. D’après les caractères spectraux, ces points neutres de deuxième espèce coïncident avec des points critiques dans les rapports entre le groupement prosthétique: et la globine.

O?Hb dans eau physiologique + HCI ou NaOK.

— Apr 's.4 6,1 7,0 8,0: 10,5 # ae LEE + AO A Les RÉ a TR | ni HE A A pH PN