B. — DISCUSSION DE LA TECHNIQUE

Il nous reste maintenant à envisager cette technique du point de vue critique, et en particulier à nous demander si les noyaux ainsi isolés sont tout à fait identiques aux noyaux vivants quant à leur teneur en ADN. Nous avons utilisé des concentrations d’acide citrique nettement plus élevées que les autres auteurs, et nous nous sommes demandé quelle pouvait être l’action de cet acide sur les tissus en général et sur la nucléoprotéine des noyaux en particulier. Pour cela nous avons procédé à deux sortes d'expériences, l’une portant sur le produit chimique isolé et l'autre sur les noyaux eux-mêmes.

Nous avons isolé par la méthode de Mirsky et Pozrisrer (171) une désoxyribonucléoprotéine de thymus de Veau et nous en avons placé une quantité connue (évaluation du poids sec) dans de l’acide citrique M/3. Après plusieurs heures et même plusieurs jours, la masse de nucléoprotéine évaluée en poids sec était absolument'inchangée, nous avons simplement constaté à la longue une sorte de rétraction et de durcissement de ce produit, une sorte de fixation au sens histologique du terme.

On sait d’autre part que l’acide citrique a une action inhibitrice sur la désoxyribonucléase, ce qui rend l’autolyse par des enzymes tissulaires impossible au niveau de noyaux en suspension dans l’acide citrique. Ceci est d’ailleurs confirmé dans notre deuxième expérience portant sur les noyaux.

Nous avons déterminé la teneur absolue en acide désoxyribonucléique de noyaux d’érythrocytes d’Oiseaux isolés dans du sérum physiologique suivant la technique décrite ci-dessus. Nous avons, d'autre part, mis une partie de ces noyaux d’érythrocytes dans de l’acide citrique M/3 pendant plusieurs heures. Enfin, nous avons étudié des érythrocytes complets traités à l’acide citrique.

Le résultat sur la teneur en ADN de noyaux ou érythrocytes complets traités à l’acide citrique, s’est révélé être absolument le même que celui obtenu chez les noyaux isolés sans acide citrique.

Ainsi nous pouvons conclure en toute certitude que l’acide citrique, bien loin de détruire la désoxyribonucléoprotéine du noyau, a une action conservatrice en inhibant l’enzyme qui détruirait normalement cette substance et en agissant comme un fixateur très doux qui en effectuerait une coagulation très progressive. D'ailleurs l'examen microscopique de noyaux ainsi préparés, soit au microscope à contraste de phase, soit après fixation et coloration au Feulgen par exemple, soit enfin au microscope à ultra-violet, montre qu’ils sonten tous points morphologiquement identiques aux noyaux examinés dans des cellules entières :n vivo ou en section.

Enfin, l’acide citrique, tout en conservant les noyaux, a une action destructive et solubilisante sur le matériel cytoplasmique, comme on peut le constater au microscope en examinant entre lames et lamelles quelques cellules entières en suspension dans l'acide citrique : on assiste à une destruction graduelle du cytoplasme qui peut être activée par quelques chocs mécaniques portés sur la lamelle. Cette destruction est d’ailleurs facilitée dans notre technique par la congélation préalable des tissus, qui rend plus fragiles les membranes cellulaires et prépare la dissociation du tissu.

En

L'ACIDE DÉSOXYRIBONUCLÉIQUE DES CELLULES ANIMALES 19 a

Eafin, un dernier point restait à élucider, la filtration et les centrifugations différentielles ne pourraient-elles avoir pour effet d'éliminer certains noyaux de taille nettement différente de la taille moyenne ? En d’autres termes, lorsqu'on traite un tissu comme le foie par exemple, composé en majorité de cellules hépatiques mais contenant en outre une certaine proportion de cellules de Kupprer, de tissu conjonctif et de vaisseaux sanguins, tous les types de noyaux sont-ils représentés dans la suspension finale ? Un simple examen au microscope permet de répondre par l’affirmative à cette question et, si nous comparons soigneusement les noyaux d’une section de foie à une goutte de suspension de noyaux isolés, nous pouvons constater que cette préparation renferme les différents types de noyaux contenus dans la coupe et qui sont aisément reconnaissables. Quant à leurs proportions respectives, il est difficile de se prononcer en toute certitude, mais il ne semble pas y avoir à ce sujet de différence frappante entre la coupe histologique et la suspension de noyaux. D'ailleurs, des expériences plus précises de cytochimie quantitative, que nous rapporterons au Chapitre Il, nous ont prouvé mieux encore que la suspension de noyaux que nous obtenons est tout à fait comparableau mélange de noyaux représentés dans le tissu vivant.

2) Numération.

Pour effectuer la numération de la suspension de noyaux ainsi obtenue, nous en mesurons le volume exact, et nous effectuons grâce à une pipette jaugée une dilution convenable d’une partie aliquote de cette suspension. Cette dilution est faite dans un tube à essai. On a déterminé par tâtonnement, en contrôlant au microscope, la dilution la plus commode pour la numération, mais avec un peu d'habitude, on reconnaît à l'œil la suspension d’un blanc laiteux et translucide qui doit convenir.

On prépare ainsi pour plus de précaution deux à trois tubes d’une certaine dilution et deux à trois tubes d’une dilution différente. On diminue ainsi les causes d'erreur pouvant provenir de la prise à la pipette, en s’assurant plusieurs contrôles.

La numération se fait dans une cellule à compter les globules sanguins (nous avons utilisé constamment l’hématimètre de Taoma). Nous effectuons une ou deux numérations pour chacun des tubes préparés. Si les résultats ainsi obtenus sont en bon accord, ce qui arrive habituellement, on en fait la moyenne. Cette numération est le plus souvent assez facile, mais un certain nombre de difficultés peuvent se présenter, et certaines précautions sont à prendre pour les éviter.

Nous allons les énumérer rapidement :

— La floculation : Nous avons constaté que si l'on effectue la dilution de la suspension mère dans l’eau distillée, il se produisait une floculation immédiate visible à l'œil nu. Au microscope tous les noyaux sont agglutinés en gros paquets, il est impossible de les compter. Ce phénomène ne se produit pas si l’on reste constamment en milieu citrique M/18, la suspension, au contraire, est remarquablement stable.

20 COLETTE VENDRELY

— Grumeaux : Quelquefois, on rencontre dans la suspension des paquets de noyaux ; nous avons vu qu’une élimination soigneuse des débris de cytoplasme ainsi que l'obtention de noyaux intacts évitait cet accident. Dans d’autres cas une simple agitation dissocie ces noyaux. D’autres fois, les grumeaux apparaissent au moment où la goutte de liquide est déposée sur l’hématimètre ; cela se produit lorsque l’hématimètre n’est pas parfaitement propre. On a donc toujours soin d’en laver la lame et la lamelle au mélange alcooléther et de les essuyer soigneusement.

— Ondes moirées : On a souvent la surprise, quand on a préparé par exemple des noyaux de thymus (organe assez gras), d’apercevoir les noyaux répartis en ondes moirées sur le compte-globule. Ce phénomène est produit par la présence d’un film de matière lipidique, formé sur la surface externe de la pipette et qui vient ensuite, par effet de surface, empêcher une répartition uniforme des noyaux dans la goutte que l’on vient de déposer. Il convient donc, avant de déposer une goutte sur l’hématimètre, d’essuyer soigneusement l'extérieur de la pipette, de laisser perdre les premières gouttes et d’essuyer à nouveau la pipette.

— Répartition des noyaux sur plusieurs plans : Il convient, avant de compter les noyaux, de faire varier la mise au point dans différents plans entre la lame et la lamelle pour s'assurer que les noyaux sont tous sur le même plan. Dans le cas contraire, il faut attendre que tous les noyaux soient déposés. Quelquefois un nombre non négligeable de noyaux adhère à la face inférieure de la lamelle ; ceci se produit encore lorsque la lamelle de l’hématimètre est mal dégraissée.

— Grosses granulations : Il nous est arrivé, très rarement, quand nous nous sommes adressés à certains matériels particuliers (hépatopancréas d’Escargot, foie de certains poissons par exemple), de rencontrer des granulations cytoplasmiques abondantes (grains de sécrétion, globules lipidiques), sensiblement de même taille que les noyaux et qu’il est impossible d'éliminer de la suspension. On est donc en présence d’un mélange de noyaux et de granulations difficiles à distinguer les uns des autres sans coloration. Dans ce cas, on effectue la dilution de la suspension mère par de l'acide citrique M/18 contenant quelques gouttes de bleu de Toluidine à 1 o/o. Les noyaux se colorent en bleu, leur chromatine apparaît, tandis que les granulations restent incolores.

Quand toutes les précautions énumérées ci-dessus sont prises, la numération n'offre pas de difficulté et les erreurs sont de + 5 0/0 au maximum.

3) Dosages chimiques,

Pour la détermination chimique de l'ADN des noyaux, nous opérons sur la suspension citrique et utilisons, avec quelques modifications, la méthode donnée par Scnnelver (209) pour l'évaluation de l'acide désoxyr ibonucléique et de l’acide ribonucléique sur les tissus animaux.

Voici en résumé la technique à laquelle nous nous sommes arrêtés :

Un traitement préalable à l’acide trichloracétique froid à 5 0/0 pendant une

nuit, permet d'éliminer l’acido-soluble, après quoi on récupère les noyaux par centrifugation. Ceux-ci sont alors soumis à l’action de l’acide trichloracétique à 5 o/o pendant 15 minutes à go degrés. Ce traitement extractif, répété trois fois, solubilise les deux acides nucléiques au prix, du reste, d’une hydrolyse partielle de ces corps, dont en particulier se détachent les purines.

Sur l’extrait trichloracétique chaud ainsi obtenu, on dose l’acide nucléique total par les purines, après une hydrolyse de 2 heures à 100° en milieu HCI/N. ‘ Les purines sont évaluées par la microtechnique de précipitation cuivreuse, mise au point par Venprezy R. et SARGIRON (252). Cette évaluation des acides aucléiques par les purines est beaucoup plus spécifique que l’évaluation qu’en a fait Scaneiner par le phosphore; d’autre part, elle évite la complication d’une délipidation des noyaux, dont ne peut se passer ScaneIper (élimination des phospho-lipides). Sur le même extrait trichloracétique chaud, on dose l'acide désoxyribonucléique par la technique colorimétrique de Discue (97) à la diphénylamine. '

On peut déterminer en outre l’acide ribonucléique par la technique colorimétrique de von Eurer (259) à la phloroglucine, ce qui permet, connaissant l'acide nucléique total des noyaux, d'obtenir par différence une seconde évaluation de l'acide désoxæyribonucléique de ces mêmes noyaux.

Dans un certain nombre de cas. nous avons recoupé les résultats ainsi obtenus, en mettant en œuvre, avec quelques modifications, la méthode donnée par ScHMIDT et THANNHAUSER (207) pour leurs travaux. Les noyaux, privés au préalable de leur acido-soluble par l’acide trichloracétique froid, sont traités pendant

TaBzeau I

Comparaison entre la technique de Scuneiner ef notre méthode.

Technique SCHNEIDER Notre méthode

1) Enlèvement du P acido-soluble par l’acide|1) Enlèvement des corps puriques acido-

trichloracétique froid. solubles par l’acide trichloracétique froid. 2) Enlèvement du P lipidique. 2) inutile 3) Extraction du P nucléique : liqueur à|3) Extraction du bloc purique : liqueur à analyser. analyser.

Dosages Dosages

1) Dosage du P organique sur la liqueur à|1} Dosage de l’N purique (hydrolyse chloranalyser donne acide nucléique total. hydrique en milieu N 2 heures au bainmarie bouillant) plus spécifique sur la liqueur à analyser donne acide nucléi-

que total.

2) Discne donne acide désoxyribonucléique.|2) Discme donne acide désoxyribonucléique.

3) Braz messaum donne acide ribonucléique|3) Von EuLER donne acide ribonucléique (aprés correction). (sans correction).

22 COLETTE VENDRELY

TABLEAU Il

Comparaison entre la technique de Scnminr el THANNHAUSER et notre méthode.

Technique Scaminr et THANNHAUSER Notre méthode

1) Enlèvement de l’acido-soluble par l’acide|r) Enlèvement de l’acido-soluble par l’acide

trichloracétique froid. trichloracétique froid. 2) Enlèvement du P lipidique par des sol-|2) inutile vants. )

3) Traitement par KOH.N 20 heures à 370.13) Traitement par KOH.N 20 heures à :70.

4) Précipitation de l'acide désoxyribonu-|4) Précipi ation de l’acide désoxyribonucléique par HCI + CCI#CO’H. cléique par HCI + CCICO'H.

Dosages Dosages

1) Dosage colorimétrique du P sur lalr) Dosage de l'N purique sur la liqueur liqueur alcaline donne Acid- nucléique| alcaline donne Acide nucléique total. total.

2) Dosage colorimétrique du P sur lal2) Dosage de l’N purique sur la liqueur liqueur acide donne Acide ribonucléique| acide donne Acide ribonucléique. plus phosphoprotéines.

3) Dosage colorimétrique du P minéral sur|3) Dosage de l’'N purique du précipité en la liqueur acide donne phosphoprotéines.| milieu acide donne Acide désoxæyribonucléique.

4) 2-3 — Acide ribonucléique.

5) 1-acide ribonucléique — Acide désoxæyribonucléique.

18 heures par la soude N à 37°. Ils se dissolvent complètement en quelques minutes. Sous l'effet de l’alcali, l’acide ribonucléique se résout en mononucléotides acido-solubles, alors que l’acide désoxyribonucléique demeure à l'état macromoléculaire et acido-insoluble. L’addition de 0,2 vol. d'HCI6 Net de 1 vol. d’acide trichloracétique à 5 o/o à la solution alcaline des noyaux précipite l’acide désoxyribonucléique (en mélange avec des matières protéiques) et laisse en solution les mononucléotides provenant de la décomposition de l’acide ribonucléique. SCHMIDT et THANNHAUSER évaluent les deux acides nucléiques par des dosages de phosphore. Nous avons préféré, ici encore, substituer des dosages de purines (après hydrolyse acide) beaucoup plus spécifiques et permettant d’éviter la complication, qui peut entraîner des pertes, d’une délipidation préalable du matériel. Notons que cette méthode est moins générale que celle de ScHNEIDER, car certaines cellules refusent de se laisser solubiliser totalement par l’alcali (les spermatozoïdes par exemple et aussi les levures et les bactéries). Dans les cas où nous avons pu l’employer avec succès, la méthode à la soude nous a donné les mêmes résultats que la méthode à l'acide trichloracétique chaud.

Dans les tableaux (I et Il) nous donnons un schéma simplifié qui fera apparaître les différences entre notre technique d’analyse et, d'une part, la méthode de SCHNEIDER, d’autre part, la méthode de ScamiDr et THANNHAUSER.

NE ee NN en A AN 7) Ar ge "qu

4) Calcul des résultats.

Une simple division de la teneur en acide nucléique d’un volume donné de

suspension par le nombre de noyaux contenus dans le même volume, permet de connaître la composition d’un seul noyau.

Erreurs. — Nos résultats comportent évidemment deux sources d’erreurs : le dosage chimique d’une part, la numération d’autre part. L'erreur sur le dosage est de + 5 0/0 et l’erreur sur la numération est également de + 5 0/0. Dans les cas les plus défavorables on aurait donc une erreur de 10 o/o. Mais remarquons que la plupart des résultats chimiques publiés représentent une moyenne entre les résultats donnés par les différentes techniques de dosage et une moyenne également entre les valeurs obtenues sur plusieurs organes d’un même type, ce qui a pour effet évidemment d’atténuer les écarts possibles. 5