A. — TECHNIQUE

a) Historique. — L’isolement de noyaux cellulaires a été réalisé depuis très longtemps. En 1856, Surrn (219) a obtenu des noyaux libres à partir de peau et de tissu tumoral par action de l'acide acétique, observation dont personne n’a

(:) Nous emploierons dorénavant pour plus de commodité, les abréviations ADN pour désigner l'acide désoxyribonucléique et ARN pour désigner l'acide ribonucléique.

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fait usage par la suite. En 1869, Miescuer (165), nous l’avons vu, a réalisé la séparation mécanique des noyaux de cellules de pus. 11 procédait de la façon suivante : les cellules de pus étaient digérées dans de l’acide chlorhydrique dilué pendant des semaines puis secouées dans une fiole à séparation avec de l’éther. Une partie se dépose à l’intertace eau-éther, l’autre se réunit au fond du récipient : ce sédiment est constitué presque uniquement de noyaux. M1esCHER isola également des têtes de spermatozoïdes de Saumon par agitation mécanique en milieu aqueux avec des billes de verre ou par emploi d’acide acétique dilué.

PLosz (190) et après lui AGKERMANN (2) et beaucoup d’autres auteurs ont isolé les noyaux d'érythrocyte de Poissons, d'Oiseaux et de Serpents par laquage de ces érythrocytes au moyen de saponine, lysolécithine, tyrothricine, etc. (108- 136-257-271) (1).

Mais il s'agissait là d'isolement des noyaux de cellules libres, c'est-à-dire plus faciles à attaquer que les cellules constituant un tissu compact. De tels isolements de noyaux aux dépens de tissus compacts ont été réalisés en 1932 par BEBRENS (16-17), qui a mis au point un procédé compliqué comportant le broyage du tissu déshydraté en poudre impalpable et séparation des noyaux plus denses par centrifugation, après mise en suspension dans un mélange de benzène-et de chloroforme ou tétrachlorure de carbone.

En 1942 BensLey (18-19) isolait des noyaux du matériel cytoplasmique par simple broyage de tissus dans du sérum physiologique et centrifugation différentielle. CLAUDE et ses élèves (67-68. 69-120), puis Lazarow (137) effectuaient également des isolements des différents constituants de la cellule, mais ces auteurs étaient plus intéressés par le fractionnement des éléments du cytoplasme que par l’obtention de quantités de noyaux bien isolés et leurs techniques ne pouvaient être appliquées ici.

Crossmox (72) utilisa le premier l’acide citrique à 5 o/o pour isoler, à partir du muscle, de petites quantités de noyaux, suffisantes pour l’étude au microscope. Mais c'est STONESURG (233) qui, s'inspirant de ce travail, mit au point vraiment la première méthode générale d’isolement des noyaux par de l’acide citrique. Sa technique fut reprise avec des modifications variées par plusieurs auteurs ; citons en parliculier Dounce (101-102), MArRSHAK (160), Von Euzer (258), Mirsxy et PoisTER (172), etc. Ces auteurs, après STONEBURG, broyaient des tissus congelés et mettaient la pulpe ainsi obtenue en suspension dans une solution faible d’acide citrique. Après agitation, une série de centrifugations permet de séparer les cytoplasmes des noyaux (?).

Nous avons repris la méthode dans son principe fondamental en la modifiant de telle sorte que la suspension de noyaux obtenue remplit les conditions nécessaires à notre problème de numération de noyaux.

b) Technique personnelle (29-253).

x) Considérations générales. — Tout d’abord, il s'agissait d’avoir un bon rendement en noyaux, c’est-à-dire, à partir d’un poids d’organe donné, d'obtenir le plus grand nombre possible de noyaux. En effet, si nos premiers essais, comme nous allons le voir, ont porté sur des organes de Bœuf et de Veau : foie, pancréas, rein, thymus, etc. que l’on peut se procurer à l’abattoir en grandes quantités, nous avons été amenés par la suite à nous adresser à

(*) Nous ne citerons que pour mémoire l'isolement de noyaux au micro-manipulateur (CHamsers, ComanDoN et De FONBRUNE) qui ne saurait être utilisé pour notre problème. à Pix F

(2) Pour ceux que cette question de l’isolement des noyaux intéresse, citons encore un travail récent dû à Wizeur et ANDERsON (266) qui isolent les noyaux du foie de Rat et de Hamster dans une solution saline et sucrée, tamponnée à

pH — 7,1.

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des animaux plus petits et plus précieux et il importait d'éviter une trop grande perte de noyaux au cours de la préparation.

Ce problème du rendement nous amena à essayer systématiquement différentes concentrations d'acide citrique et nous nous sommes aperçus que le rendement en noyaux croissait avec la concentration d'acide citrique employée, jusqu’à une teneur optima que nous avons adoptée : moléculaire/3, c’est-à-dire environ 7 0/0. Cette solution concentrée est utilisée pour le premier temps de la méthode : la dissociation des cellules ; nous avons utilisé ensuite de l’acide citrique M/18 pour éviter un contact trop prolongé des noyaux nus avec un milieu très acide (!).

D'autre part, il importait d’avoir une suspension homogène, c’est-à-dire ne contenant pas de grumeaux qui rendent impossible la numération. Pour cela, il faut que les noyaux soient en bon état et que leur membrane garde son intégrité (des noyaux étirés, partiellement déchirés s’aggloméreront bien plus facilement que des noyaux intacts). Il faut aussi que ces noyaux soient bien débarrassés des débris cytoplasmiques qui peuvent favoriser la formation d’agglutinats.

Nous obtenons ce résultat en congelant les organes dès leur récolte ; nous évitons ainsi tout phénomène de lyse enzymatique. Les tissus sont ensuite débités en fins copeaux, au moyen d’une lame de rasoir. Nous avons évité l'emploi du Waring-mixer qui nous paraît dangereux pour les noyaux. En effet, d’après Mirsky (173), le même Waring-mixer utilisé pendant un temps un peu plus long permet d'obtenir non plus des noyaux mais des chromosomes, ou plus exactement des filaments chromatiques ; il est donc à craindre que l’usage même prudent de cet instrument n’impose un début de traumatisme aux noyaux, ce que nous voulons à tout prix éviter.

L'élimination des débris cytoplasmiques se fait, d’une part, par l’immersion et l'agitation prolongée du tissu dans un acide citrique relativement concentré M/3, qui, nous le verrons, solubilise largement le matériel cytoplasmique ; d’autre part, par filtration sur papier spécial (il s’agit de ce que les Américains appellent « tissue paper ») étalé en une seule couche sur un buchner. Ce papier, dont les pores sont irréguliers mais assez larges pour ne retenir aucun noyau, s’est révélé bien supérieur à la mousseline et aux autres papiers filtre que nous avons essayés. Enfin, une série de centrifugations différentielles élimine les débris cytoplasmiques plus fins que les noyaux, la filtration ayant éliminé les autres.

Voici donc en résumé la technique que nous avons mise au point. Elle est applicable dans ses grandes lignes à tous les tissus, mais les temps d’immersion dans l’acide citrique, d’agitation et le nombre et la vitesse des centrifugations peuvent et doivent être modifiés suivant la solidité des tissus, la richesse des cellules en inclusions. etc.

B) Description de la technique.

(1) Congélation des tissus à — 25°.

(") Nous avons pu vérifier par la suite que cette précaution n'avait aucune importance, tout au moins en ce qui concerne l’étude analytique de l'ADN.

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(2) Les tissus sont finement coupés au rasoir et mis en suspension dans environ 10 fois leur poids d'acide citrique M/3 glacé (+ 2°).

(3) Agitation 15 minutes à la machine à agiter.

(4) Filtration sur « papier-tissu ».

(5) Centrifugation dans une centrifugeuse refroidie 5 minutes à 3.500 tours/minute. La liqueur surnageante est écartée.

— Le culot est repris par de l'acide citrique froid mais à la concentration M/18 et recentrifugé à une vitesse moindre (2.500 tours/minute environ).

On répète l’opératio 1 en contrôlant la suspension au microscope. Lorsqu’on a ainsi éliminé les granulations cytoplasmiques (3 centrifugations de moins en moins rapides suffisent en général), on centrifuge une dernière fois à 1.000-1.200 tours seulement pendant 5 minutes pour achever l'élimination de tous les débris cellulaires. On conserve la suspension finale dans de l’acide citrique M/18. Toutes ces opérations sont effectuées à basse température.+

On obtient ainsi très facilement de grandes quantités (!) (des grammes) de noyaux purs en excellent éfat du point de vue morphologique et en suspension homogène.

c) Cas particuliers. — Cas des spermatozoïdes (253). — Des épididymes de Taureaux fraîchement recueillis à l’abattoir sont découpés en menus fragments et placés dans des petits paniers de toile métallique suspendus à l’intérieur de tubes à centrifuger. On centrifuge pendant 5 minutes à 2.000 tours dans la centrifugeuse refroidie. Les spermatozoïdes très purs s’accumulent au fond du tube alors que les fragments d’épididyme sont retenus par la toile métallique.

On lave ensuite une ou deux fois les spermatozoïdes dans l’eau distillée et on obtient très rapidement une belle suspension, qui, après filtration sur « tissu-paper », est amenée à la dilution la plus favorable pour la numéra-

tion. Les lavages et la filtration ont pour effet d'éliminer les quelques cellules et débris qui sont mêlés au sperme épididymaire.

Cas des érythrocytes d'Oiseaux ou de Poissons (254). — Le sang est recueilli dans un large récipient contenant du sérum hépariné (1 mg./litre) et citraté (1 g. citrate au litre) pour prévenir la coagulation et empêcher l’action éventuelle d’une désoxyribonucléase. Le mélange est ensuite centrifugé à 3.000 tours pendant 5 minutes. Les érythrocytes réunis en culot sont alors remis en suspension dans une solution physiologique citratée additionnée de saponine (6 g. 0/00) et on les laisse en contact 15 minutes à la glacière en agitant de temps à autre. Il ne reste plus ensuite qu’à recueillir par centrifugation les noyaux d’érythrocytes, libérés par laquage des cellules, et à les laver plusieurs fois dans du sérum physiologique citraté pour éliminer tota-

lement l’hémoglobine.

(*) Pour donner une idée du rendement, voici quelques résultats de poids de noyaux obtenus à partir de 100 g. de tissu :

Veau : Foie : z) 460 mg.; 2) 5o2 mg. de noyaux. — Thymus : 7) 2277 et 2) 2266 mg. ; rein : 460 mg.

Porc : Foie : 1036 mg.

BULL. BIOL., fASC. 1, 1992. 3

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