A) MILIEUX DE CULTURE

De nombreux milieux de culture ont été proposés pour l’obtention de la toxine. Sans parler du milieu naturel que constituait la plèvre pour les expériences initiales de DENYS et VANDEVELDE, nous envisagerons quelques-uns des milieux qui ont été successivement employés. J. Dumas utilisait le milieu T, composé de peptone Chapoteaut 4 %, sel marin 0,5 %, glucose 0,2 %. L'auteur l’alcalinisait légèrement ct

MERCIER

examinait le pouvoir hémolytique après un séjour de cinq jours à l’étuve à 37 degrés (1914).

M. NicoLLe et CÉSARI ensemençaient dans le bouillon Martin glucosé (0,2 %) et filtraient sur bougie Berkefeld après cinq jours d’étuve à 37° (1914).

Hans Gross a utilisé le bouillon ordinaire, additionné de 1 à 4 % de peptone de Witte.

WALBUM, qui a apporté en 1924 une contribution importante à l’étude des milieux, s’était arrêté à la formule suivante :

BotHIlIonlordinaire 27 NE Re 1.000

SOLE TRUE TRE A M TR a ee q. habituelle Pentoie déaWitte pour TLOUREREVE RME 0,5 Phosphate acide de potassium, pour 100. 0,2 Sulfate demagnésiim,2pour 100 552700 0,03

Il a, par ailleurs, insisté sur l'importance du pH du milieu.

À l'heure actuelle, la plupart des expérimentateurs étrangers ont suivi la méthode de BURNET, c’est-à-dire qu'ils ensemencent dans des boîtes de gélose nutritive demi-solide (à 0,6 % de gélose) dans une atmosphère additionnée de Co. Les boîtes sont placées dans les bocaux de Mc Intosh Tildes pour la culture des anaérobies, dont l’air est remplacé par un mélange de Co? à 20 % et d'oxygène à 80 %. Les bocaux sont portés à l’étuve à 37° durant 2 jours. La gélose demisolide est éliminée et on laisse écouler son liquide à travers des sacs de gaze. Dans certains cas la toxine est concentrée en employant l’acide acétique glacial.

Mais, Ramon et NÉLIS ont préféré adapter à l’obtention de la toxine staphylococcique le milieu préconisé il y a quelques années par l’un d’eux (M. G. RAMON) pour l'élaboration de la toxine diphtérique de valeur antigène élevée.

Ce milieu est ainsi préparé :

À un litre d’eau, on ajoute 10 cc. d'HCI et 225 gr. de panse de porc fraîche, finement hachée. — On porte au bain-marie à 45° durant deux heures. On ajoute alors 325 gr. de viande de veau hachée. On brasse le mélange et on laisse à la température du laboratoire durant 20 heures. On arrête alors la

digestion par chauffage à 100°. On filtre sur étamine, puis on amène au pH 6,8-7,0 au moyen de lessive de soude. On chauffe à nouveau à 100° pendant vingt minutes. On filtre sur papier Joseph. On répartit et on stérilise vingt à vingtcinq minutes à 100°.

Ce milieu additionné de sucre (glucose 1 gr. ou maltose 2 gr. par litre) est ensemencé à l’aide d’une souche sélectionnée. Mais, la transformation en anatoxine de la toxine staphylococcique obtenue au moyen de ce milieu exige, et cela à cause de sa richesse en matières protéiques, l’addition d’une quantité relativement forte de formol 5 à 6 cc. et même davantage par litre de bouillon. Il en résulte un amoindrissement de la valeur antigène de l’anatoxine.

Aussi, à l’heure actuelle, G. RAMON préfère-t-il employer, du moins pour la culture de certaines souches, le bouillon tel qu’il est préparé à l’Institut Pasteur par G. LoIsEAU, pour la production de la toxine diphtérique.

Ce bouillon est un mélange de peptone Martin obtenue selon la technique classique, et de macération de viande de veau faite à froid (600 gr. de viande de veau pour un litre d’eau), dans les proportions de 2 parties de peptone pour une partie de liquide de macération. Le mélange est amené à un pH 7,4 puis réparti sous le volume d’un litre dans des ballons à fond plat d’une contenance de deux litres. Le contenu de chaque ballon est alors additionné de 12 gr. de tartrate de sodium. Le milieu est ensuite stérilisé à 105° pendant 45 minutes puis ensemencé à l’aide de la souche 72 de Nélis. Dans les ballons mis à l’étuve à 37°, on fait passer un courant d’air et de Co?. Le milieu se trouble dès les premières heures ; puis une fine pellicule sèche, discontinue, apparaît à sa surface, qui se désagrège et tombe au bout de 24 à 48 heures au fond du récipient. Après six à sept jours d’étuve, la culture est filtrée.

La valeur antigène de ces filtrats est en général comprise entre 10 et 15 unités. Ce milieu est donc adapté à une production régulière et prompte de la toxine et de l’anatoxine slaphylococciques.

roues

G. RAMON, en collaboration avec A. BERTHELOT, a également préconisé un milieu à base de rate de veau, qu'ils avaient employé précédemment pour la production de la toxine tétanique.

Ce milieu est obtenu de la façon suivante :

A un litre d’eau, on ajoute 500 gr. de rate de veau décapsulée et réduite en pulpe. On fait bouillir durant une heure et on passe à travers une chausse. Le liquide est ensuite additionné de peptone pepsique de viande de bœuf à raison de 15 gr. par litre, puis il est ajusté à la température de l’ébullition à pH 7,5 au moyen d’une solution de carbonate de sodium. Après chauffage à 100° pendant 20 minutes, le bouillon est filtré sur papier Laurent. On l’additionne alors d'un sel tampon. A la suite de nombreux essais fait par G. RAMON en collaboration avec À. BERTHELOT et Mille AMOUREUX, le choix s’est arrêté sur le tartrate de sodium, à Taison de 12 gr. par litre. Le milieu ainsi préparé est réparti, sous Île volume de 500 cc. dans des matras de Fernbach à fond plat, de 15 centimètres de diamètre, d’une contenance d’un litre, puis il est stérilisé à 110° durant 40 minutes. Ensemencé à laide de la souche Wood (staphylocoque blanc très toxigène), et porté à l’étuve à 37°, le milieu, sur lequel on fait passer constamment un mélange d’air et de 25 % de gaz carbonique, se trouble au bout de 5 à 6 heures. Au bout de trois jours apparaît un voile qui s’épaissit, se fragmente et tombe par lambeaux, au fond du matras.

Après une semaine de séjour à l’étuve, la culture est filtrée sur bougie L3.

Ce milieu, ensemencé avec des souches choisies à cet effet, peut fournir des toxines de valeur antigène élevée, titrant 20 et 25 unités.