B) CHOIX DE LA SOUCHE DE STAPHYLOCOQUES

De nombreux auteurs ont insisté sur ce fait que toutes les souches ne donnent pas de toxine et que parmi les souches toxigènes, on constate des variations sensibles.

La souche isolée par BURNET — lors des accidents survenus

Ole

a la suite d’une vaccination antidiphtérique, à l’aide de mélanges toxine-antitoxine, à Bundaberg, en Australie, et non pas chez des sujets atteints d'intoxication alimentaire comme le pensent H. BONNET, S. THIEFFRY et Mlle C. MONTEFIORE, — était un staphylocoque blanc.

P. NÉLIS a dû étudier plus de quatre-vingt-dix souches avant d'en obtenir une capable de donner une bonne toxine.

Nous avons, de même, recherché la toxicité de vingt-six souches de provenance humaine ou d’origine animale, sans aucun succès, le pouvoir toxigène de ces souches étant trop faible pour que la toxine ainsi obtenue puisse être utilisée pour la préparation de l’anatoxine.

G. RAMON utilise actuellement deux souches pour la production de la toxine staphylococcique : l’une, la souche Wood, est ensemencée sur le milieu à base de rate de veau ; l’autre, souche 72 de Nélis, sur milieu à base de peptone Martin et de macération de viande de veau préparé à l’Institut Pasteur par G. LoisEAU pour la production courante de la toxine diphtérique.

Il est à noter que l’on ne peut intervertir les souches et les milieux, sans constater une diminution de la toxicité des filtrats.

$ Caractères de la toxine staphylococcique .

Comme DENYS et VANDEVELDE l'ont signalé les premiers, la toxine possède le pouvoir de « gonfler, puis de lyser » les globules rouges.

Elle lyse également les globules blancs, les hématoblastes et les cellules nerveuses.

D’après GENGOU, ce pouvoir lytique s'exerce également in vitro sur les cellules hépatiques, rénales et spléniques.

Cette constatation a amené P. NÉLIS et E. PicarD à étudier, au point de vue anatomo-pathologique, les lésions provoquées par la toxine. Nous empruntons beaucoup à ces auteurs dans les considérations qui vont suivre.

P. Néus et E. PicarD ont ulilisé une toxine qui tuait un lapin de 2 kgr. à la dose d’un centimètre cube par injection intra-veineuse.

Les lésions macroscopiques peuvent manquer si la mort survient rapidement.

Mais si quelques heures se sont écoulées entre l'injection de toxine et la mort, ils ont constaté régulièrement une péricardite séreuse, accompagnée quelquefois d’un exsudat péritonéal. Dans certains cas, des suffusions hémorragiques apparaissaient dans le médiastin et à la surface du rein. Enfin, régulièrement, les auteurs ont remarqué l’hémolyse du sang prélevé immédiatement après la mort.

Les lésions microscopiques du foie sont considérables. Le protoplasme des cellules est lysé, alors que le noyau apparaît intact. Les poumons présentent des foyers de congestion. Le péricarde est le siège d’un épaississement fibrineux, mais les lésions du myocarde sont inconstantes.

Les reins sont moins atteints que le foie. Les tubes contournés sont assez régulièrement tuméfiés.

Le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques sont le siège de nombreuses suffusions hémorragiques dans les espaces intercellulaires.

Dans tous les organes prélevés, on constate la disparition des globules rouges du sang des veines.

Au point de vue physiologique, P. NÉLIS, en collaboration avec J. J. BOUCKAERT, a observé, après injection de 2 cc. 5 de toxine dans la veine jugulaire, une chute progressive de la pression artérielle au bout de quelques minutes en même temps qu’un ralentissement cardiaque d’origine sinusale. Après un temps très court, le ralentissement fait place à de la fibrillation ventriculaire qui entraîne la mort de l’animal.

La respiration se maintient normale et les mouvements respiratoires persistent quelques instants après l’arrêt du cœur.

Lorsqu'on injecte par la voie veineuse une dose moindre de toxine, la mort ne survient qu’au bout de quelques jours. Elle serait due aussi à des troubles du fonctionnement du foie, du rein et des poumons.

RE

La toxine staphylococcique est capable de provoquer la nécrose des tissus cutanés. NÉLIS a cherché également à mettre en relief son action neurotrope. Le lapin, après injection d’une très petite quantité de toxine, peut survivre. Il présente constamment une paralysie du train postérieur. Le cobaye, injecté dans les mêmes conditions, ne présente aucun symptôme de paralysie. Aussi, doit-on se souvenir de la rapidité et de la fréquence des paralysies du train postérieur chez le lapin et ne pas croire trop vite que la toxine provoque les paralysies.

Divers auteurs ont attribué à certains échantillons de staphylocoques la propriété de coaguler le plasma citraté de lapin (MucH, KLEINMILCH, GONZENBACH et GRATIA).

H. Gross a retrouvé cette staphylocoagulase dans les filtrats stériles. Mais GENGOU croit qu’elle est en grande partie retenue par le filtre.

Le problème de l’unicité de la toxine, déjà évoqué par M. NICOLLE et CÉSARI, a été repris par BURNET. Cet auteur a démontré que les diverses propriétés de la toxine vont toujours de pair et il conclut à l’unicité de la toxine.

O. GENGOU a étayé cette théorie par des expériences précises. Une toxine mise en contact avec des globules rouges perd son pouvoir hémolytique, et en même temps son pouvoir toxique.

Cependant, en 1931, Julia PARKER, en collaboration avec A. GUNTHER, arrive à des conclusions opposées. Elles pensent que l’action dermonécrotique, mise en relief par l’une d’elles en 1924, est différente du pouvoir hémolytique. Burky, plus récemment, va même jusqu’à opposer les pouvoirs hémolytique et toxique. Les filtrats très toxiques seraient peu hémolytiques.

Le problème semble être résolu depuis les recherches de NÉLis qui lui ont montré que la disparition élective du pouvoir hémolytique d’un filtrat entraînait la disparition du pouvoir nécrotique et inversement. Et avec BURNET et GEN- Gou, il conclut à l’unicité de la toxine staphylococcique.

Enfin, la propriété essentielle de la toxine staphylococ-

== Op

cique, au point de vue thérapeutique, c’est celle qui lui permet d’engendrer l'apparition de l’antitoxine, et par conséquent le développement de l’immunité antistaphylococcique. Les expériences de G. RAMoN et R. RicHOU le prouvent parfaitement.

Ces deux auteurs ont pratiqué des instillations répétées de bouillon staphylococcique très toxique dans le sac conjonctival chez le lapin, ils ont réussi à provoquer l’apparition de l’antitoxine dans le sang de l’animal et à assurer aux cellules conjonctivales une résistance certaine contre une nouvelle intoxication.

Que la toxine soit déposée artificiellement sur la conjonctive ou qu’elle soit élaborée naturellement au niveau du foyer d’ostéomyélite ou du furoncle, elle n’en pénètre pas moins dans l'intimité de l’organisme. Elle y détermine l’apparition d’antitoxine grâce au pouvoir antigène dont elle est douée. Ce pouvoir peut être facilement évalué in vitro. Nous allons voir comment.

Dosage de la toxine staphylococcique

Trois techniques usuelles permettent de mesurer le pouvoir toxique, en recherchant à la fois, la dose minima hémolytique, la dose minima nécrosante pour le derme du lapin et quelquefois, la dose léthale par injection dans la veine du lapin.

Le pouvoir antigène est évalué à l’aide de deux méthodes employées simultanément.

1° Détermination du pouvoir de combinaison de la toxine staphylococcique pour lantitoxine spécifique, par la recherche de la dose combinée hémolytique, c’est-à-dire de la dose de toxine, qui additionnée d’une quantité d’antitoxine correspondant à une unité internationale, est encore capable d’hémolyser une goutte de globules rouges de lapin. On peut également rechercher la dose combinée nécrosante, c’est-àdire la dose de toxine qui, mélangée à un dixième d’unité

Ce

antitoxique, provoque dans le derme du lapin une escarre minime, mais caractéristique.

2° On peut apprécier, d’autre part, la valeur floculante de la toxine vis-à-vis de l’antitoxine, en recherchant au moyen d’un sérum étalon, choisi à cet effet, la quantité d’unités antitoxiques qui est nécessaire pour faire apparaître la floculation initiale dans un centimètre cube de filtrat staphylococcique. Cette quantité exprime la valeur antigène de la toxine.

Voici réunis en un tableau quelques exemples de dosage de toxine par G. RAMON et R. RIcHou.

N° de Dosage du pouvoir toxique Dosage du pouvoir antigène Péchan- | = | tillon Dose Dose Dose Dose Unités de hémoly- | minima léthale | Dose combinée | combinée flocu- | toxine tique nécro- hémolytique escarri- lantes tique fiante | 1/250€ 1/400€ 0,4 3 2 1/400 1/600€ 0,25 7 3 1/600° 1/1.000€ 1/3 0,175 0,025 ne 4 1/1.000€ | 1/2.000€ 0,15 10 5 1/1.000€ | 1/2.000€ +0,125-0,15 0,020 11 6 1/1.200° | 1/2.500€ 0,10 15 7 1/1.200€ | 1/2.500€ 1/10 +0,075-0,10 0,0125 16 8 1/1.800€ | 1/2.000€ +0,075-0,10 0,0125 20 9 1/2.000€ | 1/3.000€ 1/15 +-0,05-0,075 25 10 1/2.000e | 1/3.000€ 1/15 +0,05-0,075 25 11 1/3.000€ | 1/3.000€ 1/15 +-0,05-0,075 0,010 28 12 1/4.000€ | 1/3.500° +0,05-0,075 28

Il est facile de se rendre compte de la concordance très satisfaisante dans l’ensemble des résultats obtenus avec les divers procédés. À un pouvoir hémolytique réduit correspondent régulièrement un pouvoir dermonécrotique et un pouvoir léthal peu intenses.

Certaines erreurs peuvent surgir dans le dosage de la toxine, notamment si l’on considère comme dose minima hémolytique, la plus petite quantité de toxine qui provoque l'hémolyse partielle. Il est nécessaire, comme G. RAMON, ET BoNNET, P. NÉLIS, R. RicHou et S. THIEFFRY l’ont indiqué, de n’envisager que l’hémolyse totale.

D'autre part, si l’on évalue la dose minima escarrifiante, il faut s'assurer que le lapin ne possède pas d’antitoxine staphylococcique naturelle. G. RAMON, R. RicHou et J. DESCA- ZEAUX ont d’ailleurs suffisamment attiré l’attention sur cette cause d’erreur. Elle se retrouve encore, si l’on veut déterminer la dose léthale.

Il est permis de dire, les nombreux essais de G. RAMON et R. RicHou le prouvent, que « la méthode de floculation « associée dans un but de comparaison à la méthode hémo- « lytique, nous permet d’apprécier facilement et avec pré- « cision la valeur antigène intrinsèque de la toxine staphy- « lococcique ».

La floculation initiale indique bien la saturation de deux éléments, filtrat et sérum. Le mélange est donc neutre.

Cependant, P. NÉLiIS et E. PicaRp ont montré que de tels mélanges pouvaient être encore toxiques pour l'animal. NÉLIS pensait qu’il pouvait y avoir une toxine différente de la toxine staphylococcique et il lui a donné le nom de paratoxine.

Des expériences auxquelles se sont livrés G. RAMON et R. Ricou, il résulte que les réactions sont inconstantes pour un groupe de lapins. S’il existe un poison vrai, pourquoi de nombreux lapins résistent-ils, alors que quelquesuns seulement, succombent après l’injection ?

Mais ne s’agit-il pas plutôt de lapins déjà sensibilisés naturellement, par contact avec le staphylocoque ? Ne constatet-on pas tous les jours, chez l’homme, à des degrés variables, cette hypersensibilité naturelle vis-à-vis des substances spécifiques contenues dans l’anatoxine diphtérique ou l’anatoxine staphylococcique ?

L'ANATOXINE STAPHYLOCOCCIQUE SON INNOCUITE, SON ACTIVITE IMMUNISANTE MESURE DE CETTE ACTIVITE

L'anatoxine staphylococcique est, rappelons-le, un produit de transformation dérivé de la toxine élaborée dans le milieu de culture, par des semences de staphylocoques sélectionnées à cet effet.

Elle est obtenue d’après le principe général de préparation des anatoxines en soumettant le bouillon staphylococcique, préalablement filtré et privé de tout germe microbien, à l’action simullanée, durant un temps convenable, d’une minime proportion de formol et d’une chaleur modérée.

La quantité de formol à ajouter au bouillon staphylococcique filtré pour transformer son poison en dérivé anatoxique varie avec la richesse du milieu en matériaux d’origine protéique, d’autre part, avec le degré de température auquel on soumet le bouillon formolé.

Ainsi, avec le milieu à base de peptone pepsique de viande de veau dans lequel G. RAMON obtient des toxines diphtériques de valeur antigène élevée, il faut ajouter 5 à 6 cc. de formol et même davantage par litre de bouillon toxique et le séjour à l’étuve à 40° doit être prolongé durant 4 semaines. Il peut en résulter un amoindrissement de la valeur antigène de l’anatoxine.

Aussi, quand G. RAMON a pensé utiliser le milieu peptone Martin, macération de viande de veau, ou le milieu à base de rate de veau, a-t-il pu réduire à 3 cc. 5 ou 4 cc. la quantité de formol à ajouter au bouillon toxique et abaisser à 12 jours le séjour à l’étuve. A ce moment, la transformation de

la toxine en anatoxine est complète.

‘)Q te

Une fois l’anatoxine obtenue, il est nécessaire d'apprécier ses qualités. Deux sont essentielles : elle doit avoir une innocuité absolue et posséder une certaine valeur antigène.

Pour vérifier l’absence totale de poison microbien, on utilise deux contrôles successifs : le premier, lorsque les toxines formolées sont sorties de l’étuve, le second lors de leur répartilion en ampoules. Pour chacun des deux contrôles, deux procédés sont employés simultanément. /n vitro, la toxine formolée, pure et diluée au 1/3 el au 1/10°, est mise en présence de globules rouges de lapin, afin de vérifier la disparition du pouvoir hémolytique.

In vivo, on injecte des quantités variables de filtrat formolé, 1 ec. et 1/3 de cc., dans le derme de lapins choisis à cet effet. Aucun œdème, aucune trace de nécrose ne doivent survenir.

Il faut évidemment n'’utiliser pour cette dernière épreuve que des lapins sans immunité naturelle vis-à-vis de l’intoxication staphylococcique.

Lors du deuxième contrôle, en tous points semblable au premier, on fait en outre une injection intra-veineuse de 2 cc. de toxine formolée au lapin pour constater la disparition du pouvoir léthal. Ici encore, il est indispensable de se servir de lapins rigoureusement neufs quant à l’immunité antistaphylococcique, sinon des lapins hypersensibilisés pourraient succomber après l'injection, même si lanatoxine ne renfermait plus de trace de poison.

Ces deux contrôles assurent donc une sécurité absolue. Actuellement, plusieurs centaines de litres ainsi contrôlés par G. Ramon et R. RicHoU ont été employées dans la pratique, ce qui représente plus de cent mille injections, sans qu’aucun accident sérieux ait été signalé, qui puisse être mis sur le compte d’un reste de poison dans l’anatoxine.

Le pouvoir antigène intrinsèque est évalué à l’aide de deux méthodes employées concurremment : détermination du pouvoir de combinaison de l’anatoxine vis-à-vis de l’antitoxine spécifique et appréciation de la valeur floculante en présence de lantitoxine.

NU ee

Pour la détermination du pouvoir de combinaison on utilise la technique suivante : dans une série de tubes à hémolyse qui contiennent une quantité d’antitoxine correspondant à 2 unités antitoxiques, on ajoute des doses croissantes : 0,1 ce: — 0,15 cc. — 0,20 ce. — 0,25 cc., etc., de l’anatoxine à doser. On amène le contenu de chaque tube au volume de 2 cc. par addition d’eau physiologique. Après avoir agité on laisse au contact pendant 20 minutes à la température du laboratoire. On ajoute alors dans chaque tube I goutte de globules de lapin, lavés trois fois et dilués au 1/3, puis une quantité de toxine légèrement inférieure à la dose combinée hémolytique (0,10 cc. par exemple pour une toxine dont la dose combinée hémolytique est de 0,11 cc.). Après avoir agité de nouveau on met à l’éluve pendant une heure à 37° et on fait la lecture une heure après le retrait de l’étuve. Le pouvoir de combinaison est exprimé en fonction du plus petit volume d’anatoxine qui permet l’hémolyse totale dans le système de mélanges ainsi préparés.

Pour apprécier la valeur floculante, on ajoute dans des tubes contenant déjà 5 cc. de l’anatoxine dont on cherche Ia valeur, des quantilés variables d’unités antitoxiques (sous forme de dilutions d’un sérum étalon). On agite les mélanges puis on les porte à l’étuve à 45° et on note l’apparition de la floculation initiale. La quantité d'unités antitoxiques nécessaire pour provoquer la floculation initiale dans 1 cc. d’anatoxine exprime en unités antigènes la valeur de l’anatoxine.

Il est quelquefois difficile et même impossible de déterminer le pouvoir de combinaison, surtout si la proportion de formol est assez élevée. Au contraire, la floculation donne des résultats précis et stables. C’est ici encore la méthode de choix. |

Il est indispensable d’avoir à sa disposition une anatoxine staphylococcique de valeur antigène relativement élevée, pour être en droit d’attendre des résultats thérapeutiques favorables. II nous semble qu’il faut insister sur ce point, car, jusqu’à ce jour, aucun auteur étranger, sauf DoLMax et NE- Lis, n’a suffisamment appelé l'attention sur les qualités de

Eee

l’anatoxine, et n’a fixé le nombre d’unités antigènes que doit posséder l’anastaphylotoxine pour être utilisable dans la pratique courante. Il ne suffit pas d’ajouter une petite quantité de formol à un bouillon de culture staphylococcique, pour obtenir une anatoxine inoffensive et efficace.

D'ailleurs, les réactions très fortes que l’on a observées à l’étranger au cours du traitement anatoxique, ne sontelles pas dues, pour une part, à un contrôle trop peu rigoureux de l’innocuité du bouillon ?

Et les nombreux échecs qu'ont enregistrés J. KINDEL et J. COSTELLO, CORNBLEET et RATTNER n’ont-ils pas pour cause première l’emploi thérapeutique d’une anatoxine de valeur antigène inconnue, peut-être très faible ?

Enfin, l’expérience de l’anatoxine diphtérique constitue un guide très sûr pour les anatoxines nouvelles. Or, la notion de la valeur antigène intrinsèque de l’anatoxine diphtérique n’a-t-elle pas été un des éléments essentiels du succès de la vaccination anatoxique dans la prophylaxie de la diphtérie ?