CHAPITRE II Technique

Lorsqu'on veut étudier les angines au point de vue bactériologique, on se trouve aux prises avec des difficultés presque insurmontables. Les premiers microbiologistes employaient une méthode aussi simple que rigoureuse. En effet, on recueillait avec pureté du sang et de la sérosité provenant d'organes internes comme le foie, la rate, le cœur, on les ensemençait, et les cultures pures ‘obtenues étaient inoculées à des animaux chez lesquels on reproduisait la maladie. Pour les maladies que nous étudions, presque aucune de ces conditions ne peut être remplie, il faut employer des moyens détournés, aussi compliqués que difficiles à mettre à exécution. Comme on le sait, la bouche et le pharynx, sans cesse contaminés par l’air, les aliments, les boissons, forment un terrain sur lequel se développe, à l’état normal, une flore aussi abondante que variée; il y a donc impossibilité de recueillir purement le parasite pathogène, cause de l’angine. D'autre part, les angines constituent des inflammations trop banales, dont les caractères sont trop peu nets, pour qu'on ait la prétention de les reproduire chez les animaux.

Pour la diphtérie en effet, qu'est-ce qui entraîne la conviction ? Ce n’est pas la production expérimentale de la fausse membrane, car celle-ci peut être produite par trop d'agents variés, mais l’inoculation de cultures pures amène chez les animaux des accidents qui, par leur constance, leur évolution, peuvent être considérés comme spécifiques, les para-

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lysies par exemple. Nous n'avons rien de semblable pour les angines aiguës non diphtériques.

Aussi toutes les recherches bactériologiques, faites dans ces cas, paraissent-elles peu démonstratives lorsqu'on les soumet à une critique rigoureuse. Chaque auteur, en effet, recherchant avec plus ou moins de parti pris un microbe donné, s’est mis, consciemment ou inconsciemment, dans les meilleures conditions possibles pour trouver ce microbe, négligeant trop souvent les conditions nécessaires pour révéler la présence d’autres organismes qui existaient en même temps chez leurs malades. Nous verrons plus loin quels procédés complexes il faut mettre en œuvre ponr retrouver un microbe pathogène, perdu au millieu d’autres microbes saprophytes dont la croissance rapide ne tarde pas à étouffer les espèces parasitaires plus fragiles. C’est pour échapper à ces critiques, dans la mesure du possible, que j'ai suivi la ligne de conduite qui peut se résumer ainsi :

1° Isoler et étudier les microbes qui habitent la gorge et les amygdales chez l'homme en bonne santé;

2° Isoler et étudier les microbes qui habitent la gorge et les amygdales chez l’homme atteint d'angine.

Il suffit de se rappeler la quantité considérable de travaux publiés sur les microbes de la bouche, pour comprendre les difficultés pratiques que soulèvent ces deux problèmes. Les nombreux microbes de la bouche se trouvent aussi pour la plupart dans la gorge, sur la muqueuse e& à l'intérieur des cryptes amygdaliennes. Bien que la liste de ces organismes soit fort longue, j'ai puisoler, d’une façon constante, d'autres espèces qui n’ont pas encore été décrites ; ces espèces constituent sans doute la flore spéciale des amygdales et surtout des cryptes amygdaliennes. Je ne veux pas étudier ici en détail ces microbes existant dans la gorge à l’état normal. Cette étude serait trop longue, un peu hors du sujet et fera l’objet d’un travail spécial.

Dans tous les cas que j'ai étudiés, j'ai suivi rigoureuse-

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ment la même méthode que je vais décrire une fois pour toutes. Dans un sujet aussi complexe, il est, en effet, impossible de juger la valeur des résultats et des conclusions si l’on ne connaît pas les moyens mis en usage par l’auteur, car les résultats changent complètement selon la méthode employée.

J'ai étudié des angines aiguës cliniquement très différentes (angines rouges, angines Catarrhales, angines pultacées, angines phlegmoneuses, angines pseudo-membraneuses) ; je me suis toujours astreint au principe suivant. Quelle que soit la nature de l’angine, chercher sans parti pris les microbes existant dans l'exsudat en évitant avec soin de rechercher spécialement un microbe plutôt qu’un autre. Beaucoup d'auteurs, en effet, disent avoir trouvé dans tel cas le streptocoque par exemple, mais ils ne disent pas s'ils ont recherché le bacille de Loeffler, le pneumocoque, etc. En lisant le compte rendu dela technique qu'ils ont employée, on se rend facilement compte que cette technique était justement impuissante à montrer la présence de microbes pathogènes, autres que le streptocoque, leurs conclusions ne s'appuient donc pas sur une base solide.

Façon de recueillir l'exsudat. — Lorsque je voulais faire l'examen bactériologique d'une angine, je priais le malade de se gargariser la gorge uniquement avec de l’eau bouillie ; j'évitais ainsi l'action de toute thérapeutique. J'avais préparé à l'avance une provision de pinceaux, constitués par une tige de bois à l'extrémité de laquelle était fixé un tampon de coton ordinaire. Chaque pinceau était introduit dans un tube (comme ceux qu’on emploie pour les cultures) et ce tube était bouché au moyen d’un tampon de coton.

Ces petits appareils étaient stérilisés à la chaleur sèche, 180°, au four Pasteur. On à ainsi des pinceaux sûrement aseptiques, facilement transportables, sans crainte de les infecter par les microbes de l'air.

C'est avec ces pinceaux que j'ai recueilli le matériel ser-

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vant aux expériences. Pour cela, tenant la bouche du malade largement ouverte avec l’abaisse-langue, jedébouche avec précaution un des tubes préparés comme j'ai dit, j'en retire le pinceau, et, en ayant soin de ne toucher ni la langue, ni les joues, je l’introduis dans le pharynx ; en lui imprimant un mouyement de rotation, j'essuie la muqueuse des amygdales et des piliers, et je le charge ainsi de l’exsudat recouvraut cette muqueuse. Le pinceau, retiré en prenant les mêmes précautions, est replacé dans Le tube qu’on renferme avec son bouchon de coton ; on peut ainsi transporter le pinceau chargé de matériel, au laboratoire, sans crainte de l’infecter avec les microbes étrangers. Bien entendu, on peut charger avec le même malade deux ou trois pinceaux. Au laboratoire, les pinceaux sont retirés’ et secoués avec soin dans un tube de bouillon stérilisé, on les débarrasse ainsi de l’exsudat dont ils étaient chargés ; le bouillon est agité fortement pour dissocier et c’est ce mélange qui va servir aux ensemencements et aux inoculations.

Préparations microscopiques. — On a eu soin de réserver un des pinceaux qui, au lieu d’être lavé dans le bouillon, est essuyé sur des lamelles pour permettre l'examen microscopique de l’exsudat (1). Ces lamelles étaient colorées par différents procédés (picro-carmin, solution hydroalcoolique de violet de gentiane, méthode de Gram, etc.) etexaminées au microscope.

Ensemencements, — Le bouillon contenant en suspension l'exsudat, servait en partie à ensemencer différents milieux de culture ; une autre partie était employée à inoculer des animaux réactifs. & |

Par les ensemencements, je me suis proposé d'isoler et de cultiver les espèces microbiennes recueillies sur la muqueuse du malade. Il va sans dire que ces espèces

(1) Dans un seul cas, nous avons pu faire des coupes sur un fragment de muqueuse et colorer les microbes dans les tissus, ce qui est bien plus dé-

monstratif (voir obs. 24).

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étant toujours très nombreuses, on ne pouvait pas songer à obtenir d'emblée des cultures pures. Tout le monde sait avec quel succès Koch et ses élèves ont employé, pour isoler les microbes, la méthode des plaques, méthode devenueclassique. C’est cette méthode que j'ai employée tout d'abord.

Cultures sur plaques de gélatine. — Je faisais fondre plusieurs tubes de gélatine ; dans l’un d’eux je versais une goutte du bouillon contenant l'exsudat, je l’agitais, je prenais une goutte de cette gélatine ensementée et je la portais dans un second tube de gélatine. ce deuxième tube servait à ensemencer de même un troisième tube. Ces tubes de gélatine étaient coulés dans des boîtes de Pétri, on laissait faire priseet on les transportait dans une étuve à 18-20°. On avait ainsi des plaques de gélatine dans lesquelles les bactéries pouvaient se développer en donnant des colonies plus ou moins nombreuses selon Ja dilution.

Ce procédé permet d'obtenir des colonies pures, mais il est tout à fait insuffisant pour plusieurs raisons.

Sur gélatine à la température de 20°,le développement est lent (7 à 8 jours), pendant ce temps la plaque était un peu exposée à s'infecter par les microbes de l'air.

Certaines espèces liquéfiantes se développaient rapidement, envahissaient la plaque avant que les autres espèces aient formé des colonies suffisamment grosses pour pouvoir être recueillies.

Enfo, ce qui est plus grave, c’est que certains microbes pathogènes qu'il y avait lieu d'incriminer dans les añgines, bacille de Loefller, pneumocoque, ne poussent pas sur plaque de gélatine à cause de la température trop basse.

Parle procédé des plaques de gélatine, on n'obtient ainsi que certains microbes de la bouche non pathogènes, les moins nombreux, les moins intéressants.

Culture sur plaques de gélose. — On pouvait remédier à ces inconvénients en remplaçant la gélatine par la gélose et

en procédant d’ailleurs de la même façon. Les plaques de gélose pouvant être mises à l’étuve à 37°, on obtenait un bien plus grand nombre d'espèces qu'avec les plaques de gélatine.

Mais les colonies microbiennes, enfermées dans l'épaisseur de la gélose, ont presque toutesles mêmes caractères, et il devenait presque impossible de distinguer les espèces ; la plaque de gélose se dessèche rapidement à l'étuve, et, au bout de quarante-huit heures, toute croissance s'arrête. Enfin il est à peu près impossible d'isoler par ce procédé le bacille diphtérique et le pneumocoque dont la fragilité est trop grande pour qu’ils puissent pousser dans ces conditions.

Culture sur gélose en surface. — Aussi, au bout de peu de temps, j'ai renoncé à cette méthode des plaques coulées dans des boîtes de Petri.

Voici comment j'ai procédé :

J'avais des tubes à essai de fort calibre (2 centim. de diamètre), je remplissais le quart du tube environ avec de la gélose à 1 1/2 p. 100, les tubes étaient bouchés et stérilisés à l’autoclave. Pendant qu’ils étaient encore chauds on les couchait et on les laissait refroidir. J'obtenais ainsi des tubes dont la gélose était étalée en large surface grâce au calibre et à la longueur du tube. Les tubes doivent être conservés debout, de telle façon qu’à la partie inférieure s’'amassent quelques gouttes de liquide exsudé (c'est pour cela qu’il faut employer de la gélose à 1 1/2 p. 100) ; en mettant par-dessus le bouchon de coton une capote de caoutchouc, l'évaporation ne peut se faire et on a ainsi une large surface de matière nutritive, se maintenant humide et complètement à l'abri des poussières extérieures.

Ordinairement on se contente de promener à la surface de la gélose de ces tubes une aiguille de platine chargée d’exsudat, c'est l'ensemencement par stries. Mais ce procédé est défectueux. En effet, on étale une masse de microbes insuffisamment dissociée ; les colonies sont le

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plus souvent impures, sinon confluentes, et, grâce à cette trop grande promiscuité, nombre de microbes fragiles sont étouffés par le développement de microbes plus vigoureux; aussi les auteurs qui ont employé ce procédé ne parlent-ils que de deux, trois ou quatre espèces.

Pour obvier à cet inconvénient, j'introduis dans ün des tubes, préparés comme j'ai dit plus haut, une goutte de bouillon dans lequel on a lavé les pinceaux ; cette goutte de bouillon est mélangée au liquide exsudé par la gélose, on agite le tube pour bien faire le mélange et surtout dissocier les agrégats microbiens. En inclinant le tube, on promène le liquide sur toute la surface de la gélose, puis on redresse le tube et on à ainsi une véritable plaque dans laquelle tous les microbes sont séparés, mais ensemencés à la surface et

non dans l'épaisseur de la gélose. Bien entendu, pour avoir -

des colonies suflisamment espacées, je fais des dilutions, c'est-à-dire que je puise, avec une aiguille de platine ou une pipette eflilée, une goutte de liquide dans le premier tube, ensemencé comme je viens de dire, et je transporte . cette goutte dans un deuxième tube, auquel on applique les mêmes manipulations; ce tube peut servir à son tour à ensemencer un troisième pour avoir une troisième dilution.

Par ce procédé, on obtient, comme dans les plaques de gélose, des colonies bien isolées, pures, se developpant facilement, car, dans les tubes dilués, les colonies sont éloi« ‘gnées les unes des autres et, de plus, les tubes, étant fermés par une capote. de caoutchouc, il n'y a pas de dessiccation. Enfin, ce qui est très important c'est que les colonies, se développant à la surface de la gélose, possèdent des caractères différentiels tels qu'on peut reconnaître les espèces différentes, et, par conséquént obtenir des cultures pures en pêchant avec une aiguille de platine ces colonies eten les réensemençant,

C’est par ce procédé que j'ai pu obtenir des colonies de microbes, qui, jusqu’à présent, n'avaient pas été décrits

dans la bouche; ils ne se développent pas, en effet, par d’autres procédés.

On obtient ainsi facilement les microbes pathogènes comme le staphylococcus pyogenes aureus, le staphylococcus pyogenes albus, le streptococcus pyogenes et même le pneumocoque.

Culture sur sérum. — Cependant, il était encore un microbe dont je ne pouvais pas déceler la présence par ce procédé, c'est le bacille de la diphtérie. Ce bacille, en effet, pousse bien sur gélose, mais seulement lorsque l’ensemencement provient d'une culture pure, préalablement faite sur milieu artificiel. En un mot, le bacille diphtérique qui n’a pas encore passé par un milieu de culture, qui vient directement du malade, pousse très difficilement sur gélose. . On sait, depuis les travaux de Loefiler, de Roux et Yersin, que le meïlleurmoyen de déceler la présence du bacille diphtérique est de semer l’exsudat sur sérum solidifié. Aussi, dans tous les cas que j'ai étudiés, non seulement j'ai semé le bouillon contenant l’exsudat dans des tubes de gélose comme j'aidit plus haut, mais encore je l'aisemé sur plusieurs tubes de sérum, je pouvais donc affirmer la présence ou l’absence de bacilles diphtériques..

Inoculalion. — Le procédé des cultures, quelque perfectionné qu'il soit, était loin d’être suffisant, car certains microbes, peu cultivables ou trop fragiles, pouvaient passer inaperçus; le pneumocoque, par exemple, qu’on peut dans certains cas isoler par la culture, m'aurait, le plus souvent, échappé sije ne l’avais pas recherché par d’autres moyens.

Le bouillon, dans lequel était délayé l’exsudat, était introduit dans une seringue stérilisée de Straus et inoculé à différents animaux (souris, lapins, cobayes); malheureusement, je n'ai pu, dans tous les cas, inoculer autant d'animaux, et, le plus souvent, j'ai été obligé de m'en tenir à la souris. D'ailleurs, des expériences comparatives m’engagent à croire que l’inoculation au lapin et au cobaye ne m'aurait rien appris

de plus. Donc, dans tous les cas, j'ai inoculé au moins une ou deux souris. Pour cela, je coupais les poils de la peau au niveau d’une cuisse et je faisais l’inoculation sous la peau. Les poils coupés indiquaient la place de l’inoculation. Pour éviter des infections étrangères, la peau, au niveau de l’inoculation, était très légèrement cautérisée avec une pointe de verre chauffée.

La souris inoculée présentait, dès le lendemain, au point inoculé, une réaction inflammatoire. En effet, tous les microbes introduits sous la peau, tendent à se développer, mais ceux qui ne sont pas pathogènes sont rapidement détruits, etne continuent à se développer que ceux qui sont plus ou moins pathogènes, même au bout de quelques jours ne subsistent qu'une ou deux espèces les plus virulentes pour la souris. : À

Dès le lendemain de l’inoculation, au moyen d’une pipette stérile, très effilée, je ponctionne la peau (préalablement stérilisée par une légère cautérisation) au niveau de la petite tumeur inflammatoire, je retire ainsi un peu de pus ou de sérosité roussâtre. Ce pus ou cette sérosité était examinée au microscope, et ensemencée sur les milieux et par les procédés semblables à ceux que j'ai déjà décrits. Le surlendemain, on retirait d’autre pus qu’on traitait de même ; si la souris mourait, le sang et les organes étaient soumis à l'examen microscopique et étaient ensemencés. J'arrivais ainsi à obtenir les espèces microbiennes pathogènes pour la souris. Dans quelques cas complexes, j'ai été obligé d’inoculer une deuxième souris avec le pus de la première et de faire ainsi des passages. Ce procédé m'a permis d'isoler des microbes qui existaient chez le malade à l’état peu virulent ou en très petite quantité. Je reviendrai sur ce sujet en donnant les résultats des expériences et des observations.

En résumé, chaque cas d'angine était soumis à trois ordres de recherches : r ;

1° Examen microscopique de l’exsudat extrait purement de la gorge du malade ;

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2° Ensemencement de cet exsudat sur des milieux de culture variés, dans des conditions telles qu'il était possible d'isoler le plus grand nombre des espèces microbiennes vivant dans cet exsudat ; 3° Inoculation de cet exsudat à la souris permettant d'obtetenir certains microbes pathogènes, très fragiles, qui auraient pu échapper par l'emploi isolé des deux procédés précédents.

Cette méthode n’est pas à l'abri de tout reproche, et il faut en reconnaître les nombreuses imperfections. D'abord elle est extrêmement laborieuse, chaque cas d’angine, pour être ainsi analysé bactériologiquement, exige un mois et demi à deux mois de travail quotidien au laboratoire. Mais ce qui est plus grave, c’est que, malgré sa complexité, elle est encore insuffisante. En effet par son emploi, il m'est impossible d'isoler les espèces microbiennes anaérobies qui ne sont pas pathogènes pour la souris, rien dans mes expériences n'étant capable de déceler leur présence. Dans un certain nombre de cas j'ai recherche les anaérobies, maisil faut employer une techniquetoute spéciale et tellement laborieuse que le temps m'a manqué pour l’employer concurremment avec la méthode précédente ; ces recherches seront continuées plus tard. D'ailleurs les quelques expériences que j'ai faites me conduisent à penser que les résultats obtenus ne sont en rien infirmés par l'insuffisance de ce genre de recherches.