II. Mode opératoire

La manière d'opérey est généralement assez simple. Néanmoins il serait difficile de formuler des règles fixes sur ce point,

I. Lorsqu'on veut assister au début de la réaction, le mieux est de procéder comme suit : on place à l'avance la préparation sans véhicule entre les deux verres ; on dépose, avec une baguette de verre bien propre, une goutte de réactif sur le porte-objets et contre le verre à couvrir, et l'on met immédiatement l'œil au microscope.

Il est encore bien d'autres circonstances où ce mode d'opération à sec est seul applicable. Il en est ainsi, par exemple, lorsque la présence de l'eau entre les deux verres nuirait soit au réactif soit à la préparation elle-même. Le premier cas se présenterait pour la dissolution alcoolique d'anchusine, dans la recherche des graisses ou des huiles essentielles : cette résine étant insoluble dans l'eau se précipiterait immédiatement. Il se présenterait également, si l'on était obligé d'employer l'acide sulfurique anglais à l'état de pureté, l'alcool absolu, l'éther, etc. D'un autre côté, l'eau enlèverait des cellules mises en expérience les substances qui y sont solubles ou qui sont déjà dissoutes dans le suc cellulaire, telles que les grains d'aleurone, les saccharoses, les glycoses, l'asparagine, l'inuline, les acides organiques, et même le glycogène et les dextrines.

II. Dans tous les cas semblables, il va de soi que l'usage de l'eau est prohibé. A part ces cas, du reste assez nombreux, il est généralement permis de déposer la préparation dans une gouttelette d'eau distillée. Comme il ne s'agit plus ici d'observer la structure normale des éléments cellulaires, que l'osmose pourrait altérer, mais bien de constater la présence ou de déterminer la nature chimique d'un corps donné, l'usage de l'eau n'a plus d'inconvénients. Au contraire, sa présence favorisera souvent l'imprégnation de la préparation, et empêchera l'air d'y pénétrer.

Lorsqu'on n'a pas de raison spéciale d'agir autrement, il vaut mieux déposer la goutte de réactif sur la préparation, avant de la recouvrir de la lamelle : la pression que celle-ci exerce sur les objets rend plus difficile la pénétration des liquides. Elle est donc excellente, aussi à ce point de vue , la méthode qui consiste à dissocier les objets dans le réactif lui-même.

L'observation que nous venons de faire s'applique particulièrement à l'emploi des réactifs colorants. Aussi au lieu d'opérer sur le porteobjets, est-il souvent préférable de déposer les coupes ou les objets dans un verre de montre, et de les y laisser dans le réactif pendant le temps voulu : ils se colorent ainsi plus facilement et plus régulièrement. En agissant de cette façon il est aussi plus facile de saisir les objets et les passer, au sortir du réactif, dans l'eau ou dans l'alcool pour enlever l'excédant de la matière colorante.

146 EMPLOI DKS RÉACTIFS

Cette méthode est souvent employée pour la coloration du noyau à l'aide du picrocarmin, des couleurs d'aniline, de la safranine, de l'hématoxyline, etc. Pour pratiquer ces colorations on peut employer deux procédés.

1° Coloration à laide de solutions diluées.

On laisse séjourner les objets pendant de longues heures — 24 à 48 — dans une solution très faible de matière colorante. Grâce à l'action élective des éléments du noyau, on parvient ainsi à ne colorer que ce dernier, ce qui peut être avantageux dans certaines circonstances. Malheureusement un aussi long séjour dans l'eau est de nature à modifier l'état naturel de la nucléine; c'est pourquoi les cytologistes ont souvent recours de nos jours à la méthode suivante.

2° Stir coloration suivie de décoloration.

Ce procédé est surtout employé avec la safranine, le violet de Paris et les anilines en général ; il est connu sous le nom de méthode de Hermann (').

a) Flemming opère de la manière suivante. Les coupes sont laissées, pendant 10 à 12 heures, dans un mélange à parties égales d'eau distilée et de solution alcoolique concentrée de matière colorante. On les lave à l'eau, on les déshydrate par l'alcool, rapidement pour ne pas enlever la matière colorante du noyau; on les traite ensuite par l'essence de girofle et on les inclut dans la laque de dammar.

b) Victor Babes vient de préconiser une méthode un peu différente. Il place les objets dans une solution aqueuse sursaturée, contenant de petits cristaux en suspension; il chauffe jusqu'à ce que le liquide devienne clair, ce qui a lieu après quelques secondes. On laisse refroidir pendant quelques minutes, on lave à l'eau et à l'alcool; puis, après avoir traité les objets par l'essence de térébenthine, on procède à leur inclusion dans le baume. Ce mode opératoire est avantageux : il est expéditif, il permet de ne laisser les objets que pendant quelques instants dans l'eau, enfin, en employant l'essence de térébenthine, il empêche la matière colorante du noyau de diffuser comme cela a lieu avec l'essence de girofle. Nous devons avouer qu'il nous a donné de bons résultats. Néanmoins nous préférons toujours nous servir du vert de méthyle, lorsqu'il s'agit d'étudier la structure normale du noyau ; ce réactif agit vite et bien dans toutes les circonstances, même entre les deux lamelles, et sa partie excédante s'enlève par l'eau avec facilité, le noyau seul restant coloré.

III. Les réactifs exigent parfois un temps assez long pour que leur

(1) BôTTCHER und Hermann, Tagblatt. d. Graz. naturf. Versuch., 1875, p. io5. - Voir Flemming, Archiv f. milcr. Anat., 1881, t. XIX, p 3i7.

(2) Victor Babes (iu), Ueber einige Fârbungsmethode, etc.; Archiv f. mikr. Anat 1883 t XXII, p. 356. - Pour obtenir la solution aqueuse dont nous parlons on porte une solution ordinaire avec un excédant de safranine à la température de 60", et l'on filtre à chaud.

POUR l'analyse microchimique 147 effet soit complet. On fait toujours bien de conserver sous cloches les préparations traitées, afin de les soumettre plus tard à un nouvel examen. Il est parfois nécessaire, ou du moins utile, de chauflfer la préparation, pour déterminer ou accélérer l'action du réactif. Cest ce qui a lieu avec le réactif de Millon et la liqueur de Fehling. On se sert à cet eflfet de la lampe â alcool, de letuve, ou du bain-marie.

IV. On est souvent obligé d'enlever le réactif, après qu'il a agi sur la préparation, sans toucher à la lamelle. A cet effet, on dépose contre le verre-à-couvrir une goutte d'eau, d'alcool, etc., suivant le cas, et on incline légèrement le porte-objets pour faciliter la pénétration entre les deux verres. En même temps on soutire le réactif du côté opposé, à l'aide du pinceau ou du papier buvard. En répétant cette opération, on finit par laver entièrement la préparation. C'est ainsi qu'on élimine les acides, les bases, l'excédant des réactifs colorants, etc. C'est ainsi également qu'on remplace un véhicule par un autre.

En général, quand on doit traiter un objet par plusieurs réactifs successifs, il est à conseiller, si rien ne s'y oppose^ de laver la préparation après l'application de chacun d'eux : par exemple, après avoir traité les grains de fécule par la potasse pour en enlever la granulose, on lavera à grand eau, avant d'employer l'iode destiné à mettre en évidence leur squelette cellulosique.