COAGULATION DU SANG CITRATÉ

Pour faire coaguler un sang citraté, il n'est pas nécessaire théoriquement d’ajouter de substance étrangère. Il doit suffire que l’ion-calcium inactivé redevienne actif. Peut-être, — mais l'expérience est à faire, — le passage d’un simple courant électrique suffirait, qui modifierait l’état électrolytique des sels calciques du sang citraté. En fait, nous avons constamment observé que le sang citraté n'est incoagulable que pendant un certain temps; il finit toujours par coaguler spontanément en 2? ou 3 jours. Et nous nous sommes demandé, — sans pouvoir jusqu'ici le vérifier, — si l'influence prolongée des conditions extérieures (parois du vase, air, etc...) ne parvenait pas à la longue à rendre au calcium l’état physique nécessaire à la coagulation, même en présence de citrate, de même que dans le sang pur, nous supposons que les influences extérieures donnent brusquement au calcium du sang sorti des vaisseaux, le pouvoir « précipitant » qui va déchaïner les actes de la coagulation physiologique.

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Addition de calcium neuf au sang citraté. __ Introduit sans précautions et en excès dans notre sang citraté, le calcium neuf y détermine subitement une coagulation aussi rapide et aussi complète que la coagulation du sang pur.

L'observateur est donc gèné, comme dans la coagulation physiologique par l’excessive rapidité du phénomène. Mais, au lieu d'introduire le calcium neuf en excès, ajoutons-en au sang citraté des quantités très minimes mais croissantes : jusqu'à une certaine quantité il ne se produit rien; puis arrive un moment où une trace de calcium ajoutée sera « active » sur une partie du mélange citraté. Une coagulation partielle se produit. (C'est ce que nous appellerons : le seuil de la coagulalion). À mesure que les quantilés d'ions neufs croissent, une quantité plus grande du mélange coagule. Puis, on arrive à la quantité d'ions calciques suffisante pour mettre en jeu la totalité des forces coagulantes et toute la masse sanguine envisagée coagule (c’est la coagulation complète).

Chaque dose de calcium déchaine l'activité d’une certaine quantité de substances coagulantes. Dès que l'énergie de ces dernières est suffisante, elles produisent du coagulum (minime et incomplet — seuil de la coagulation).

La coagulation s'arrête quand cette énergie est épuisée.

Pour la continuer et l’achever, de nouvelles doses de calcium sont nécessaires, qui libèreront l’activité du

reste des substances coagulantes.

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Ainsi, on peut arriver à fraclionner la coagulation et à connaître les doses de calcium neuf nécessaires pour faire débuter la coagulation et suffisantes pour l’achever.

Nous sommes donc en possession d'un moyen qui nous permet de ralentir à notre gré l'acte coagulant, de l'arrêter à sés premières phases ou à mi-chemin ou de le mener au stade de coagulation complète.

Mais l'observation, si elle n’est plus empêchée par la question rapidité, est encore gènée par un autre fait : la masse sanguine envisagée esl un milieu dense, épais, opaque, qui se prête mal à des lectures délicates. Pour rendre les phénomènes qui s’y passent facilement appréciables à l'œil, il est nécessaire de recourir à un artifice : c'est la dilution.

La dilution. — Examinons ce qui se passe quand, dans une solution chlorurée isotonique, on laisse tomber une goutte de sang. Elle se répand en volutes rougeâtres qui, par agitation, se dissocient complètement et donnent au liquide un aspect rosé, trouble, moiré.

Laïssons quelques heures au repos. Au bout d’un temps. variable, notre solution saline est complètement éclaircie et a repris son aspect limpide, eau de roche. Au fond du tube est lassée une masse rouge globulaire que, par agitation, on voit se détacher, flotier en une lentille compacte et parfaitement coagulée.

Ainsi, le sang dilué même dans une masse considérable de liquide isotonique finit par se coaguler complètement comme si les éléments coagulants du plasma, d'abord répartis dans toute la masse, élaient venus chercher au fond du tube les globules rouges qui s’y sont lentement déposés.

Bien entendu, il faut que la masse diluante ne soil pas trop considérable. Au fur el: à mesure que l’on s'écarte par excès

+ de la dilution optima, on voit une quantité de plus en plus grande de globules rouges rester libres hors du coagulum. Pour un trop grand excès de véhicule, aucun globule rouge n’est plus englobé. Il ne.se forme plus dans le liquide qu'un petit flocon fibrineux, blanchâtre.

Par tâtonnement, nous avons déterminé que la dilulion Maxima, pour que tous les globules rouges soient compris dans le caillot, est de 1/100° : par exemple, 100 centimètres cubes de liquide isotonique pour 1 centimètre cube de sang. A cette dose, le seul effet de la dilution sur la coagulation du sang physiologique est un retard énorme du phénomène (1). Mais pour être retardé, il ne s’en produit pas moins intégralement, et le caillot obtenu dans la masse liquide est équivalent à celui du sang pur. |

(1) Sropec. Influence de la dilution sur le lemps de coagulation in vitro. Soc. de biol. 14 nov. 1903.

FRACTIONNEMENT DE LA COAGULATION. — DÉTERMINA- TION DU SEUIL DE LA COAGULATION ET DE LA COA-

GULATION COMPLÈTE.

D'après ce qui précède :

Jo Il est possible de citrater le sang au sortir du vaisseau, dans une proportion telle qu'il reste incoagulable d'une façon prolongée tout en conservant ses forces coagulantes intactes.

2 Il est possible de rendre à ces forces coagulantes leur activité par addition de sel calcique neuf; à trop petites doses, la coagulation n’est que partielle et débutante ; si on fait croître les doses ajoutées, on assiste à la coagulation de plus en plus complète jusqu'à la coagulation totale.

3° Pour rendre la série des phénomènes facilement appréciable, il est nécessaire de procéder à une dilution qui, faite dans la proportion de 1/100° n’a sur la coagulation d'autre effet que de la retarder.

Il est un moment, où une certaine dose de sel calcique, n’aclivant que de trop petites doses de substances coagulantes, il ne se produit dans la masse citratée,

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» diluée, aucune coagulation; tandis qu’à la dose immédiatement supérieure, la coagulation débute, pour devenir de plus en plus complète au fur et à mesure que la dose calcique se rapproche de celle qui est nécessaire pour la prise totale de la masse,

Les premières manifestations de la coagulation débutante constituent le « seuil de la coagulation ».

Entre le seuil et la coagulation complète, on obtient une série d'images qui nous représente les étapes du phénomène depuis son début jusqu’à son achèvement.

Ainsi, on arrive à retarder, à étaler la coagulation sanguine, à l’immobiliser dans ses phases successives.

Le phénomène physiologique si rapide, si subit qu'il était impossible à étudier directement se trouve ralenti à l'extrême, et on pourra en observer chacune des phases comme on observerait, sans qu’elles sefusionnent, chacune des images d’un film cinématographique tour-

nant avec une extrême lenteur.

Technique.

Elle se ramène à trois points principaux :

lo La citratation. — Elle se fera au lit du malade, dès que le sang sort du vaisseau.

2 L'addilion de calcium neuf. — Elle se fera au laboratoire, dans des tubes successifs qui contiendront des doses croissantes de calcium, permettant d'observer toutes les phases depuis le seuil, jusqu’à la coagu-

lation totale.

90 La dilution. — Condition essentielle d'observation facile : elle se confondra, comme nous allons le voir avec

les deux précédentes.

Nous avons vu que la dilution optima élait de 1/100e.

Dans le premier temps, — citratation, — le sang se trouvera dilué au 1/5°.

Dans le deuxième temps, — calcification, — cette première solution sera diluée au 1/20°. Finalement, la dilution sanguine sera de 1/100°.

1e ParTiE. Citratation. — Au sortir du vaisseau, le sang doit recevoir instantanément la quantité de citrate qui « limmobilisera », le « stabilisera ».

Pour rendre le sang incoagulable d'une façon prolongée, la teneur en citrate doit être de 1/100°, c’est-àdire que pour 1 centimètre cube de sang, 1l faudra 1 centigramme de citrate.

Le citrate dont nous nous servons est le citrate de soude commun du commerce et des pharmacies (citrate trisodique). . C’est un sel très stable qui finit pourtant par s’effleurir. Le sel employé pour la fabrication des solutions doit être frais.

Le dosage des quantités introduites doit être très exact. Nous prélevons, comme nous l’indiquerons, 1 cm* de sang. Il nous faut le mélanger, aussi exactement que possible, avec un cenligramme de citrate.

Pour cela, le plus commode est de se servir de citrate en solution exactement titrée, mais très étendue et de mesurer en volumes, ce qui diminue les chances d'erreur.

Nous avons vu que la première dilution sanguine devait êlre de T1 pour 5, soit 1 cm° de sang pour 4 em du liquide diluant. Le centigramme de citrate nécessaire à l’incoagulabilité de 1 cm’ de sang, devra donc être contenu dans 4 em

Se

de liquide. Autrement dit, le mélange doit être effectué avec une solution citratée à 1/400e.

Cette solution doit être isotonisée; voici la formule du mélange citratant, diluant :

CIREATENISOdIQUE M MO TURN 1oTe NOUS EE RE A TROT.

Pau dise NE 1 100 6r:

Préparation facile ne nécessitant d'autre précaution que la pesée et la mesure très exacte des composants. (Le chlorure de sodium a sur la coagulation une action retardante qui s'ajoute à celle due à la dilution).

Prélèvement du sang. — C'est le point le plus délicat de la technique, celui qui prête le plus aux causes d'erreurs et nécessite le plus d'attention.

1° Il faut réduire les phénomènes de contact au minimum.

2° Il faut mesurer rigoureusement le volume de sang

prélevé.

Ces deux conditions s'opposent l’une à l’autre. En effet, pour éviter les contacts et obtenir un sang aussi semblable que possible au sang circulant, il faut que presque instantanément au sortir du vaisseau le sang se trouve citraté et dilué. A partir de ce moment, de par la dilution et l’immobilisation des forces coagulantes, les phénomènes de contact ne sont plus à redouter.

Mais d'un autre côté, la méthode nécessite que le volume de sang soit rigoureusement mesuré. L’aspiration du sang à l’aide d’une seringue graduée ne répond ni à l'une ni à l’autre des conditions, parce que les seringues ne sont pas graduées très exactement, parce que on n'y apprécie à l'œil un certain volume qu'avec une approximation insuffisante, parce que c'est un temps supplémentaire qui retarde le moment où le

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sang sera citraté et surtout met le sang pur en contact avec les parois de la seringue, toutes conditions propres à amener des altérations graves.

Le procédé de prélèvement suivant tourne les difficultés et nous semble le meilleur par la rapidité avec laquelle le sang se trouve simullanément mesuré, citraté et dilué avec minimum de contacts étrangers :

Le sang est prélevé dans une veine du pli du coude; nous nous servons d’aiguilles de platine très courtes et grosses; l’aiguille de platine sera très sèche; le mieux sera de la flamber; on évitera de placer les doigts sur l’'embout par où le sang va sortir, et enfin, on laissera écouler une certaine quantité de sang avant de prélever celle dont on veut faire l'étude.

Immédiatement au sortir de l'aiguille, on présente au sang la solution citratée dans laquelle instantanément il se dilue et «s’immobilise » par inactivation de son calcium.

Pour cela, nous nous servons de très petites éprouvettes graduées en dixièmes de centimètre cube, de 8 centimètres

de haut et de 1 centimètre de diamètre. Ces éprouvettes sont - exactement calibrées et graduées.

Supposons que nous voulions recueillir très exactement un centimètre cube de sang. Il serait extrêmement difficile de

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* l’apprécier directement par la hauteur de colonne de liquide, car invariablement le sang sortant en gouttes préssées, on en recueille trop ou trop peu.

Aussi faut-il user de lartifice suivant :

Au lieu de commencer à verser dans l’'éprouvette les 4 cm de solution citratée, diluée, on n’y verse que la moitié (la mesure exacte se fait par afflcurement du ménisque inférieur au chiffre 2). Puis, on présentera bien verticalement l’éprouvettle à l’embout de l'aiguille de façon que le sang tombe dans le liquide sans toucher les parois. On enlève l'éprouvette quand le niveau s’est élevé aux environs de 3; mais jamais le cm*° de sang ainsi prélevé n’est exact; il s’en faut de un ou plusieurs dixièmes de centimètre cube, en plus ou en moins. Aussi, on ne complètera pas le volume de la solution citratée, diluante à 5 cm° par addition des 2 cm? manquants; mais on fera une correction par excès ou par défaut % après le calcul suivant :

Un cm° de sang pur dans la solution que nous désirons obtenir doit correspondre à 4 cm° de la solution citratée au 1/400° (un centigramme de citrate).

Un dixième de centimètre cube de sang pur doit donc correspondre à 0,4 de la solution citratée au 1/400°.

On ajoutera dans l’éprouvette les 2 cm° manquants de la solution citratée, augmentés ou diminués d'autant de fois 0,4 qu'on aura recueilli dans l'éprouvette de dixièmes de centimètre cube de sang pur en plus ou en moins.

Par exemplé, supposons qu'au lieu d’avoir reçu dans l'éprouvette 1 em° de sang on en ait reçu 1 em? 2? (le ménisque inférieur est au chiffre 3,2 au lieu du chiffre 3), au lieu de compléter le volume total à 5 cm”, on ajoutera 2cm° + 2 fois 0,4 —%2 cm° 8 de la solulion citratée. Le volume total sera de 5 cm°8, mais le mélange sera exactement dans la proporüion de 1 pour 4, absolument comme si on avait ajouté 1 cm? de sang idéalement exact à 4 em? de solution cilratée.

De même si au lieu de 1 cm°on en a recueilli 0,8, on

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complètera seulement le volume à 4,2 (on ajoute 2cm° — 2 fois 0,4).

Ainsi, nous voilà en possession de sang très exactement dilué à 1 pour 4 dans une solution citratée, telle que la proportion de citrate de soude est de 1/100: (1). Le mélange sanguin ainsi obtenu possède intactes toutes ses propriétés coagulantes, Il est transportable.

Il défie les contacts altérants de par sa dilution.

Il est incoagulable par inactivation de ses sels calciques.

2° PARTIE. Addition de calcium actif. — La forme sous laquelle on introduira les ions calciques. neufs n’est pas indifférente. Tous les sels de calcium ne sont pas utilisables. Ainsi, les iodures, bromures, sulfates ne peuventservir, — le dernier étant insoluble, les premiers donnant lieu à la formation dans les tubes d’iodures et de bromures de sodium nocifs.

… Le sel d'élection est le chlorure de calcium. Par réaction sur un excès de citrate de soude, il ne peut former que du chlorure de sodium dont le seul effet sera d'élever un peu le taux de la liqueur en NaCIL. (C'est pourquoi nous avons choisi le titre isotonisant de nos solutions un peu

bas : 7/1000°).

Mais, alors que le citrate de soude du commerce pouvait servir tel quel à préparer nos solutions, le chlorure de calcium commun est inulilisable. C'est un sel très hygromé-

(1) Pour ces mesures, comme pour les mesures ultérieures, nous nous SA de pipettes graduées en dixièmes de centimètre cube, très longues e fois plus longues que celles quiservent dans la réaction de Wassermann) où chaque dixième esl très facile à apprécier. ,

robe

. Wique, dont lateneur en eau est très variable, et qui se prête + mal à des titrages rigoureux. (Il en existe 5 variétés depuis l'anhydre fondu qui absorbe d’ailleurs très rapidement l’humidité atmosphérique, jusqu'aux variétés hydratées qui contiennent de 1 à 6 molécules d’eau).

Il peut de plus être impur et contenir en particulier de la chaux qui le rend hyper-alcalin (1). Aussi pour avoir une solution exactement titrée et pure, est-il nécessaire de la fabriquer spécialement (2).

Par le procédé que nous indiquons, il est possible d'obtenir une solution de chlorure calcique rigoureusement titrée et exempte d'impuretés.

C’est sous cette forme que nous allons introduire les ions calciques neufs, actifs dans notre sang citraté dilué.

Disposirir. — Dans une série de tubes, nous allons répartir des quantités égales de notre sang cilraté. Nous nous servons de tubes du type dit : « à hémolyse ». Nous avons dit que la dilution finale du sang doit être de 1/100e. Dans chaque tube, nous introduisons la même quantité de 2/10° de cm’ de notre sang cilraté, lequel, on se le rappelle, est déjà dilué au 1/5°. Pour que la dilution sanguine finale soit de 1/100°, il faudra que chaque tube contienne 4 em’ de liquide isoto-

nique.

(1) A la moindre surchauffe dans sa préparalion, il se produit la réaction : CaCE + H20 — 2 HCI + Cao

(2) On part d’une solution d'HCI chimiquement pur à 20/100°. On la neutralise par du carbonate de chaux pur du commerce ajouté par pelites quantités. ,

On fait bouillir pour chasser l'excès d'HCI. On laisse refroidir et sur une prise d'essai, on titre avec une solution d'AzO’Ag, telle que 1em* = 1 centigramme de CaCE. Il est alors facile d'étendre la solution au titre voulu. La solution ainsi préparée ne contient pas d'autre impurelé que du carbonale de chaux en quantité très faible de l'ordre de 0,002 pour 100.

LR O0 EE

Avant la prise de sang, on prépare la série des tubes contenant les doses de sel calcique et la solution diluée isotonique.

On part d’une solution de chlorure de calcium à 0 gr. 5 p. 1.000.

| 2/10 de em“ de cette solution contiennent . . . . O0 gr. 0001 CaCF 3/10 de cm° de cette solution contiennent . 0 gr. 00015 — 4/10 de em de cette solution contiennent . . . . O gr. 0002 —

ECS

Pour que les volumes définitifs de nos. tubes soient égaux, il est nécessaire d'y introduire d'autant moins de solution diluante isotonique (chlorure de sodium

pur à 7/1.000) qu'on y introduit plus de la solution eal-

cique.

Aïnsi, notre série de tubes préparés d'avance sera ainsi composée. (Voir tableau I, p. 93).

C'est à ce moment qu'on procède à la prise du sang qu'on obtient dans l’éprouvette exactement mesuré, citraté, dilué.

À l’aide de longues pipettes graduées, on introduit dans chacun des tubes 2/10: de em* du sang citraté, dilué, Ce dernier s'y répand en volutes; il est nécessaire d'assurer l’homogénéité du mélange par agitation, jusqu’à aspect moiré rougeûtre.

Rappelons en volume et en poids la contenance de chaque tube (Voir tableau II, p. 93).

Il suffit maintenant d'abandonner la série de tubes au repos, à une température aussi constante que possible et voisine de 18 à 20.

RÉSULTATS. — Observons nos tubes 12 à 15 heures

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