SALONS

tincte; par ce procédé, la ‘coloration, très souvent, ne réussissait pas, c'est-à-dire que la granulation neutrophile, l’azurophilie des myélocytes pâlissait beaucoup et parfois disparaissait complètement. Dans une coloration d’une heure et sans laver largement, la granulation se présente fortement accusée.

Avec le May-Grünwald employé dans sa forme courante le résultat était inutilisable car ni les noyaux des polynucléaires et des mononucléaires, ni leurs protoplasmes n’apparaissaient -colorés distinctement.

La relation de la basophilie du protoplasme et la basophilie du noyau était très variable dans la même préparation et seule la granulation neutrophile et éosinophile, cette dernière surtout, était bien distincte. Pour les myélocytes, et les promyélocytes, Klein trouvait cette coloration sans aucune waleur; il affirmait d'autre part que la modification d’As- -smann donnait de meilleurs résultats. Les noyaux étaient bien distincts, toutes les granulations colorées assez intensément, mais les structures nucléaires ne présentaient pas de détails. Pour cette raison Klein introduisait une modification à cette méthode qu'il ne trouvait pas inférieure à la méthode de Giemsa. Sa méthode était. la suivante : il versait sur les frottis de sang desséché quelques gouttes de la solution de May-Grünwald en le laissant s'épaissir à l'air libre (5 à 10 minules); après quoi il versait © à 10 centimètres cubes ‘pour une goutte de 1/1000 carbonate de potasse en remuant bien jusqu'à obtention d'une solution bleu-violet transparente, sans nuage el uniforme. Vingt minutes après il rejetait le liquide et séchait au buvard. Les colorants, disait-1l, pouvaient rester pendant 12 heures en contact avec la préparation, mais alors les noyaux se montraient très colorés et dans ce ca$ on devait les laver quelques minutes à l'eau.

De cette facon Klein prétendait obtenir la granulation neutrophile jeune et vieille colorée d’une façon qu'aucune autre méthode ne mettait en évidence. Il montrait qu'avec la solu-

BÉTANCÈS à

mie

ton de Giemsa on n'oblenait pas toujours un bon résultat si on ne la laissait pas s’épaissir et si on n’employait pas de l'eau alcalinisée. Il voyait que cette solution de Giemsa même contenant de l'azur ne réussissait pas toujours et que d’autres fois il ne se formait pas en elle de lazur. R Le mélange de May-Grünwald dont se servait Klein ainsi que de nombreux hématologistes jusqu’à présent, commençait à être utilisé depuis 1902. Ce mélange dérivait du premier

mélange colorant et fixateur de Jenner (1899) basé sur

l'emploi des colorants neutres dissous dans un liquide indifférent tel que l’alcool méthylique (méthode imaginée par Jenner) et encore du mélange de Leishman (1901) basé sur la même méthode de Jenner et qui produisait les mêmes effets tinctoriaux que le mélange de Romanowsky. Le mélange de

«May-Grünwald est simplement un éosinate de bleu de

méthylène dissous dans l'alcool méthylique (50 centigrammes pour 100 centimètres cubes). D'autre part l’éosinate de bleu de méthylène de May-Grünwald, tel qu'il fut con&u par son

auteur, ne devait pas être transformé en azur, mais, d'après.

la modification de Klein, on peut voir que l’action du carbonate de potasse détermine la formation de l’azur (1).

Le mélange colorant de Giemsa est connu depuis 1904: son auteur s’inspirait du mélange de Romanowsky et l'effet

produit par l'azur dans ce mélange, lequel pour cette époque

était déjà isolé, malgré que sa nature restât inconnue. Depuis 1904 Giemsa a modifié maintes fois la formule de son liquide colorant et la technique de son emploi (1907,

(1) Il est très difficile d'avoir de l’éosinate du bleu de méthylène qui ne conlienne des impuretés capables de donner naissance à Pazur.

Ce mélange de May-Grünwald SObIONE jusqu'à présent en combinaisons avec le

mélange de Giemsa ou avec le mélange de Panchrôme de Pappenheim constitue ainsi Ja méthode panoptique, conçue par ce dernier auteur, pour remédier à l'insuffisance colorante du May-Grünwald qui devait seulement colorer les éléments

neutrophiles et basophiles après mise en liberté, par l'addition d'eau, du colorant

neutre. Presque tous les auteurs qir ont étudié Ja granulation azurophile ont ulilisé cetle méthode.

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1910 et 1914). Composé d'abord d'azur II éosine et azur, dissous dans un mélange d'alcool méthylique et de glycérine, 1l présentait quelques inconvénients et ne donnait pas une coloration suffisamment puissante ; parfois, il paraissait que la fixation des frottis du sang était insuffisante par l'alcool absolu ét que l’acétone rendait le colorant instable. Dans un flacon contenant depuis quelque temps de la solution de Giemsa, il y avait touiours un peu de violet de méthylène.: En: 1907 Giemsa abaissait la teneur en glycérine de la solution, de 50 p. 100 à 25 p. 100, et enfin, en 1914, il donnait une nouvelle méthôde rapide de coloralion, en employant d’abord un nouveau liquide particulier « Farbfixierlôsung nach Giemsa » et ensuite en faisant agir une de ces solutions déjà connues.

En 1911 Pappenheim combinait un mélange « Panchrom » du type Giemsa, lequel, contenant du bleu de méthylène, bleu de toluidine, azur 1, violet de méthylène, éosine, dans un mélange d’alcool méthylique, glycérine et acétone, possédait quelques facultés colorantes qui manquaient aux solutions du type Giemsa et de Leishman. Ce mélange colorant était employé après fixation, conjointement au colorant de May- Grünwald, constituant ainsi la méthode panoptique May- Grünwald-Panchrome de Pappenheim.

Kardos, en 1911, en voyant l'inconstance des colorations de la granulation neutrophile non mûre dans les cellules qui contenaient en même temps la granulation azurophile myéloïde (promyélocytes et leucoblastes) par les méthodes colorantes de Giemsa et ses dérivés, arrivait à faire un mélange colorant qui, s'il est vrai qu'il donnait des fois les résultats désirés, n'avait pas toutes les qualités requises pour être complètement substitué au May-Grünwald Giemsa ou

au May-Grünwald-Panchrome. Kardos disait que son mélange colorant avait des avantages sur les colorants de Giemsa qui perdaient leur force colorante après un temps plus où moins

Dors RE

long; qu'il permettait dé différencier nettement la granulation neutrophile mûre effilée et sombre, la granulation neutrophile non mûre mat et la granulation azur grossière myéloïde dans un plasma encore basophile, condition très avantageuse lorsque ces granulations se trouvaient dans une

même cellule.

Le colorant de Kardos était composé, en principe, par moitié d'un mélange d’une solution de Giemsa et. d’un mélange triacide (vert de méthyle, orange) mélange, disait son auteur, d'équilibre théorique, qui devait permettre de trancher la question de la différenciation de la granulation neutrophile mûre et non mûre, de la granulation azurophile. Il pensait aussi que la présence du vert de méthyle permettait de conseïver l'azur dans des solutions claires. Toutefois il était d'avis que le Panchrome de Pappenheim était le seul qui pût donner le même résultat. s Scott, Thomson et Hydrik (1910), trouvant insuffisante la coloration de Romanowsky pour colorer les cellules éosinophiles et neutrophiles, disaient être arrivés à obtenir un mélange colorant, par un procédé combiné de Leishman et de Giemsa, procédé qu'ils considéraient comme parfait, expliquaient leurs expériences äu point de vue chimique. Ils ne s'expliquaient pas que l'effet de Romanowsky s’obtenait par l’action de l’éosine sur le bleu de méthylène. Les auteurs dans leurs critiques de la coloration de Romanowsky et des mélanges dérivés de celle-ci qui contenaient de l'azur, disaient que la coloration qu’ils obtenaient de la granulation azurophile était une coloration neutrophile, parfe que leur préparation ne contenait pas d'azur et pourtant mettait cette granulation en évidence. Ils admettaient d'autre part que si les: noyaux des trypanosomes apparaissaient parfois comme des vacuoles non colorées, après coloration par le bleu de méthylène, la cause en tenait à leur indice de réfraction, d’où leur aspect légèrement basophile, qui ne tenait pas à une

SRE TR 2

vertu spéciale du mélange éosine-bleu de méthylène-azur. Le mélange de Scolt reste secret et on sait seulement «qu'il contient de l’éosine-thionine ou de l'éosine dimethylethionine, éosine écarlate, bleu de méthylène. Pappenheim, la même année, répondait aux critiques de Scott en disant-que les essais de coloration Romanowsky en se servant de May-Grünwald seul sans djouter de l’azur, \ avaient été plusieurs fois tentés. La maison P. Altmann, de Berlin, avait un mélange semblable, mais qui n’était pas autre chose qu'un mélange May-Grünwald-Romanowsky. De ce . mélange appelé « azéométhine », Pappenheim disait qu'on pouvait comparer les méthodes américaines de Wright et Hasting dans lesquelles les deux liquides colorants agissent séparément. D'après Pappenheim, la méthode de Scott serait la seule comparable à celle d’Altmann qui reste secrète et qui, sans contenir de l'azur, pouvait donner les résultats du mélange de Romanowsky.

Au sujet du mélange d'Allmann on n'ajoutait pas d'azur, mais celui-ci existe tout de même.

Langeron dans son Précis de Technique microscopique (1916), parmi d’autres questions sur l'azur, disait que l’azur de méthylène n’est pas autre chose que le produit d’oxydation du bleu de méthylène en solution alcaline, que dans les solutions vieilles de bleu de méthylène il se forme spontanément sous l'influence de petites quantités d'alcaline provenant du verre, que sa propriété essentielle est de produire une coloration spécifique de la chromatine et en général des substances dites azurophiles, coloration qui ne se produit qu'en présence d’une couleur acide, particulièrement Péosine, qui agit seulement comme agent chimique et probablement … comme mordant, puisqu'on peut le remplacer par d'autres corps tels que la résorcine, la pyrocatéchine, l'hydroquinone, ete. Non seulement, dit Langeron, la coloration de la chromatine est plus intense que tout ce qu'on peut obtenir,

mais encore elle est spécifique pour la chromatine des protozoaires. Langeron pense que pour une raison encore inconnue les propriétés de l’azur ne se montrent pleinement qu'en présence du bleu de méthylène, ou du violet de méthylène qui est un dérivé du bleu de méthylène produit par action des alcalins concurremment avec lazur de méthylène en proportion variable.

Bernthsen, Michaelis, Giemsa, refusent tout pouvoir colorant au violet de méthylène dans la réaction de Romanowsky. L

En 1904, Unna lui donnait un rôle considérable dans son bleu polychrome, et Marino, dans la même année, préconisait son emploi simultanément avec l’azur de méthylène dans la coloration de Romanowsky. Mac Neal (1906) croit qu'il peut remplacer l’azur dans la coloration Romanowsky et Pappenheim (1911) confirmait cette opinion. En tout cas il ne colore pas comme l’azur d’autres substances basophiles non chromotropes et la coloration azurophile qu'il donne est. moins intense que celle obtenue par l’azur. Ÿ

Dernièrement, et depuis 1915, Tribondeau, en collaboration avec Fichet et Dubreuil entreprit une série de travaux sur l'éosinate de méthylène, l’azur et le violet de méthylène,

d’une grande importance et dont les résultats sont incomparables.

Tribondeau comprend dans les éosinates de méthylène,

le colorantde Laveran, de Leishman de Giemsa, sonbi-é6osinate, son azur, etc. Avec la méthode de Laveran (bleu Borrel-éosine]} Tribondeau. arrive à préciser par des épreuves de précipitation, commeil Les appelle, les proportions dans lesquelles les deux colorants doivent être mélangés ; il introduit une modification du bleu Borrel et en même temps une modifi- cation à toute la méthode de Laveran. Pour la préparation de l’azur et du violet de méthylène pour laquelle Giemsa garde un secret de fabrication, Tribondeau arrive à le pré-

5 Æ = Die

parer d’une manière très simple et sûre. Il ne croit pas que son azur soit identique à celui de Giemsa (chlorhydrate d'azur), mais les résultats qu’on obtient avec lui ne laissent rien à désirer. L'auteur obtient les éosinates de méthylène en les dissolvant dans Falcool absolu et ajoutant une certaine quantité de glycérine afin d'obtenir la stabilité de solution. Son bi-éosinate est un mélange neutre d’éosinate de bleu Borrel et d’éosinate de bleu ordinaire, tous les deux en solution dans l'alcool éthylique absolu glycériné. En observant que le premier, malgré. qu'il colorait parfaitement la chromatine des parasites et les granulations leucocytaires, précipitait vivement en le mélangeant à l'eau et que le second n'avait pas la propriété colorante complète désirée, il est: arrivé par la combinaison des éosinates à obtenir un liquide colorant qui donne des résultats panoptiques parfaits.

Son azéo est un éosinate d'azur additionné d'un excès de colorant basique (azur libre).

Plusieurs autres liquides colorants dérivés du Giemsa et basés sur la méthode de Romanowsky eten principe de celle de Jenner, ont été utilisés dans les études hématologiques, mais pas avec l'intention de mettre spécialement en évidence la granulation azurophile, la différencier des autres granulations leucocytaires, cu pour faire une classification histologique des cellules sanguines. Dans l'étude de ces Jiquides on n'a pas tenu compte non plus du rôle prédominant que joue l'éosinate d'azur du bleu de méthylène et de là des raisons pour lesquelles plusieurs chercheurs ont interprété la granulation azurophile comme une granulation neutrophile ou basophile.

Considérations générales tirées des faits historiques. e .

Si nous avons fait un exposé historique aussi étendu sur la granulation azurophile, sur le colorant azur et sur quel-