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Technique d'examen de frottis desséché. — Nous sommes convaincus que l'examen de frottis desséché est le plus sûr pour l'étude de la granulation azurophile et celui aui donne les meilleurs renseignements histologiques de la cellule sanguine, des liquides séreux et d’autres tissus.

Une des premières précaulions que nous avons toujours eues dans l'examen du frottis desséché a été d’avoir des lames bien propres, bien dégraissées et de ne pas faire le frottis Lrop épais de façon qu'il finisse avant le bord de la

lame. Nous avons toujours fait les étalements en nous servant

d’une lamelle propre en ayant soin de ne pas appuyer fortement de façon à ne pas écraser les éléments cellulaires, en agissant rapidement-pour que le sang ne se dépose pas et en séchant le plus rapidement possible.

L'étalement des autres liquides organiques a été fait de la même façon; pour le liquide péritonéale du cobaye le séchage immédiat est tout à fait nécessaire. En étalant le’ sang de cobaye il faut procéder très rapidement.

Nous avons observé que dans les frottis de sang de cobaye les cellules polynucléaires se groupent fréquemment en un seul point de la préparation, laissant tout le reste de la prépara- Uon parsemé seulement de mononucléaires.

D'autre part les cellules très fragiles présentent souvent des phénomènes de lyse qui rendent impossible une classification et une énumération exacte des globules blancs. Pour éviter ce résultat fâcheux nous avons dû étaler le sang toujours immédiatement après sa sortie du vaisseau sanguin, rapidement, sans pression, le plus mince possible et en séchant bien, sans perte de temps.

Ces inconvénients qui se présentent quelquefois dans le

-frottis de sang humain sont plus fréquents encore dans le frottis du sang de cobaye. C'est pourquoi nous donnons une grande importance à toutes ces précautions.

Nous nous sommes aperçus que beaucoup d’énumérations

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‘de sang de cobaye ont été faussées à cause du manque de -soin dans l'exécution de ces détails techniques. Les frottis une fois séchés doivent être fixés et colorés de façon à -obtenir des images sanguines parfaites.

Coloration des frottis desséchés. — L'étude de la granula- ‘ion azurophile reposant presque exclusivement sur l'examen -de sang desséché et coloré, nous avons dû apporter un soin spécial à nos préparations afin d'obtenir des images cellu- Jaires tout à fait parfaites dans lesquelles les structures et affinités chromatiques du noyau et du cytoplasme puissent être bien définies et affirmées.

Nous nous sommes servis d’un matériel : lame, lamelle, -pipette, éprouvette, flacon compte-gouttes, etc... très propres -en changeant toujours le matériel sali par le colorant. L'eau que nous avons employée a toujours été neutre ou légèrement alcaline, condition indispensable pour obtenir une bonne coloration avec le colorant qui contient l’éosinate d’azur du bleu de méthyiène.

Giemsa recommande en effet comme réactif pour l’eau dis- : tillée, la solution alcoolique, d'hématoxyline et donne la technique suivante : dissoudre dans l'alcool à 95 p. 100 quelques cristaux d'hématoxyline ou faire une solution de 10 p. 100 d'hématoxyline dans l'alcool de 90° et prendre 10 cc. de cette solution pour 90 cc. d’eau distillée. Prendre 10 ce. d’eau à essayer et ajouter 2? gouttes de la solution incolore ou jaunâtre, ajouter à la provision d'eau dislillée et goutte à goutte une solution à 1 p. 100 de carbonate de sodium ou de potassium jusqu'à ce que l’eau éprouvée par l'hématoxyline prenne au bout de 5 minutes une coloration violacée faible mais nette.

Tribondeau recommande de toujours épurer l’eau distillée de la facon suivante : ajouter à chaque litre d'eau 5 centigrammes de carbonate d'argent et redistiller l’eau ; le sel d’argent fixe énergiquement les acides, aldéides, chlorures, etc.

BÉTANCÈS 4

Nous nous, servons depuis 10 ans de l’eau de pluie qui

nous à toujours donné de bons résultats; bien filtrée, on peut la conserver dans des flacons bouchés à l’émeri.

Les frotiis de sang desséché ou les liquides séreux, ont

été fixés soit par l'alcool absolu méthylique où éthylique, soit par l'alcool éther, lorsque nous nous sommes servis du colorant de Giemsa, en submergeant la lame pendant 15 ou 20 minutes dans un flacon contenant un de ces liquides et en la laissant sécher spontanément après sa sortie. En utilisant la méthode panoptique de Pappenheim nous avons fixé par le mélange May-Grünwald. Avec le colorant de Tribondeau, par le même mélange bi-eosinate.

. Pour la première méthode, une fois le frotuis fixé dans l'alcool absolu ou dans l’alcool-éther, nous avons versé sur la préparation une solution de 1 goutte de liquide de Giemsa (Giemsa’s Lüsung für Romanowskyfarbung) de Grübler, dont la formule est ordinairement

AUDI ÉOSITIEN. PS RITES TRE 3 gr.

ANTULDAE PES UE Cr CRE DÉC NE TE 0 gr. 8 Glycérine. AU \25er:

Alcool méthylique. . MITHIEL.

avec 15 gouttes d’eau de pluie. On laisse agir cette solution pendant 15 à 30 minutes, on rejette le colorant et on lave à l'eau courante. Le frottis de sang est coloré très proprement et ne présente pas de précipités. Les hématies apparaissent colorées en gris violacé, le cytoplasme des cellules mononucléaires en bleu ciel pâle, tous les noyaux en rouge violet; les granulations neutrophiles en rouge clair presque rose, les granulations éosinophiles rouge brillant et les granulations des Mastzellen violet. Les granulations azurophiles entre les tons rouge et rouge-violet.

S'il est vrai qu'avec cette méthode de coloration et en suivant loutes les indications données par Giemsa dans la

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Deutsche med. Woch. n° 12, 1910 (eau neutre ou légèrement alcaline; mélange non concentré ; propreté absolue de matériel; non agitation du mélange, etc. pour éviter la précipitaüon de l'éosinate d'azur) on peut obtenir des préparations rapides, très belles et parfaites, il y a des insuccès dans son emploi, lorsqu'on se sert d'un mélange colorant qui, nous

ne savons pas pourquoi, ne donne pas une coloration panop-

tique, même en observant les indications de Giemsa. On a incriminé la fixation imsuffisante par l'alcool, l’âge du mélange et sa fabrication, mais nous ne savons rien puisque, nous étant servis de quatre mélanges sortis de la maison Grübler : deux frais et deux vieux, les résultats ont été parfaits avec un frais et un vieux, mauvais avec les deux autres.

La seule chose que nous ayons observée est que celui qui présentait un ton violent pur a été utilisable et que celui qui présentait un ton bleu-verdâtre n’a pu l'être. A notre avis, il s’agit d'un défaut de fabricalion. \

Pour la seconde méthode nous avons fixé avec une dilution de 50 centigrammes d’éosinate de bleu de méthylène de May-Grünwald dans 100 centimètres cubes d'alcool méthylique absolu, en versant sur le frottis 15 à 20 gouttes, de façon qu'il soit couvert complètement et en le laissant agir pendant 3 à 5 minutes. Sans rejeter cette dilution, nous avons ajouté un même nombre de gouttes d'eau de pluie et nous avons encore laissé agir 5 minutes. Après cela nous avons rejeté ce mélange et sans laver nous avons recouvert le frottis, pour le colorer définitivement, avec une dilution de 7 gouttes de la solution Panchrome de Pappenheim dont

la formule est la suivante :

Bleu de méthylène . gramme.

Bleu de toluidine. . . . .

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. Violet de Méthylène. . .

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AR Un AIÏCO0L MÉNYIIQUE NM + RL ML OO NPAMNTÉSS GIVCÉRINEC UE EME RNCS NT NCA CT RE 200 grammes. AIGÉLOTIE AE RC ENT AE EEE NN rs RERO OE 50 grammes.

avec D centimètres cubes d’eau de pluie. Après 15 à 25 minutes, nous avons rejeté le colorant et avons plongé la préparation dans l’eau courante pendant un temps suffisant (15 minutes à une demi-heure) pour enlever quelques parcelles de bleu précipitées ou plus exactement jusqu'à obtention d’une différenciation nette de tous les tons.

À notre avis, celle méthode ést tout à fait parfaite et donne tous les résultats désirés, toutefois nous devons ajouter les précautions que nous avons prises pour obtenir ces résultats.

D'abord mettre les lames avec le frottis de sang sur un chevalet bien nivelé, ne jamais laisser sécher ou s’épaissir la solution de May-Grünwald, condition indispensable, et pour cela se servir d'une quantité suffisante de cette solution. Une autre condition, plus délicate encore, est de surveiller la différenciation lorsque fa lame est plongée dans l’eau. Le ton que doit présenter le frottis après coloration doit être un ton violet-rougeàtre (outre-mer-vermillon, garance-sépia).

Lorsque la coloration est trop intense, on peut différencier aussi par un mélange d’alcool acétone à 79 p. 25 ou par l'alcool à 90°; rarement nous avons eu besoin de recourir à celte différenciation. Avec cette méthode, tous les éléments sont bien colorés avec des nuances particulières qui éorrespondent aux réactions cylologiques connues : acidophihe, neutrophilie, basophilie, métachromatie et spécialement azurophilie. Les détails nucléaires et cytoplasmiques sont parfaitement mis en évidence.

La troisième méthode, celle de Tribondeau, nous a paru encore préférable. Nous nous sommes servi du mélange biéosinate préparé par la maison Poulenc Frères, avec un dispositif semblable à celui que nous avons utilisé pour le Panchrome de Pappenheim. Nous avons fixé et coloré en

d'A et

même temps le frottis du sang avec ce mélange bi-éosinate, de la façon suivante : en faisant agir 19 à 20 gouttes du liquide de Tribondeau pendant 3 minutes et en ajoutant un nombre égal de gouttes d'eau de pluie que nous mélangeons très doucement au liquide colorant et que nous laissons agir ainsi pendant 15 à 20 minutes; après ce temps, en lavant à l'eau courante légèrement et séchant rapidement au buvard.

La méthode ne peut être ni plus commode, ni plus rapides seulement nous avons pris les mêmes précautions que pour la solution de May-Grünwald, c’est-à-dire ne laisser jamais sécher da solution de bi-éosinate sur la lame et en nivelant celle-ci. D'autre part, l’eau ne doit pas contenir même des traces d'acide.

Les résultats que l’on obtient avec cette méthode sont les mêmes qu'avec la méthode panoptique May-Grünwald-Panchrome de Pappenheim; toutes les réactions chromophiles

sont représentées avec des nuances plus belles encore. Les autres avantages de cette méthode sont sa facilité et son économie.

L'éosinate de Tribondeau est un mélange neutre d’éosinate de bleu de Borrel et d’éosinate de bleu ordinaire, tous deux en solution dans l'alcool éthylique absolu glycériné à 1 p. 10 (alcool 90, glycérine 10). Les deux solutions d'éosipate sont préparées d'abord séparément el Tribondeau emploie une modification dans la préparation du bleu Borrel qui lui permet d'éviter qu'il rougisse en vieillissant et qu'il précipite en donnant un azur de méthylène. Il emploie aussi une technique spéciale pour l'obtention de l'éosinate de bleu de méthylène pur non transformé. Il procède de deux façons différentes pour l’obtention des deux éosinates de méthylène : 1° par combinaison directe dans l'alcool glycérique; 2 par.

précipitation préalable en pratiquant ici l'épreuve de précipttation. Pour les associer, il prend en général trois parties d'éosinate de bleu ordinaire pour cinq parties d'éosinate de

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bleu Borrel. Pour les détails de toute cette préparation, nous renvoyons aux Annales de l'Institut Pasteur n° 8, 1917.

Pour l'examen des liquides séreux après coloration nous avons suivi la même technique que pour le sang.

Examen des organes. — Nous avons employé pour l'étude de la granulation azurophile dans les cellules des organes hématopoiétiques et autres la technique des coupes, frottis, empreintes (principalement ces deux dernières). Nous sommes arrivé à faire des froltis et des empreintes parfaits et plus commodes que les coupes; avec celles-ci on n'obtient pas les cellules bien écartées avec un protoplasme large et de cette façon la granulation azurophile n'est pas facile à observer, tandis qu'avec les frottis ou les empreintes on peut avoir les cellules avec un protoplasme large, étendu, donnant la granulation facilement visible. D'autre part les colorations avec les solutions colorantes déja connues sont plus réalisables dans ces dernières.

Nos frottis et nos empreintes ont été fixés et colorés indistinctement frais ou desséchés; nous avons eu soin de les faire toujours le plus mince possible et de ne pas frotter les morceaux de tissu dont nous nous sommes servi, plusieurs fois sur la lame, afin de ne pas écraser les éléments cellulaires, Pour les empreintes nous appliquons légèrement l'organe sur plusieurs points de la lame, parfois il nous a fallu sécher un peu la surface de l'organe dont nous allions faire le frottis avec du papier buvard. Quelquefois pour la moelle osseuse et pour le foie, nous nous sommes servi de l'alcool-éther pour dégraisser les frottis.

Les prélèvements d'organes ont été faits par petits mor-.

Ceaux et Jamais en raclant les tissus ou en les comprimant avec la lame, pratique que nous avons trouvée mauvaise ; pour la moelle osseuse nous avons pris de pelites parcelles que nous avons passées légèrement sur la lame lorsque la

moelle provenait du fémur: au contraire nous passions la

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