RÉACTIFS MINÉRAUX

Rouge de rulhénium

C'est surlout avec le rouge de ruthénium ou oxychlorure de ruthénium, découvert par Joy et appliqué par Man@ (7) à l'étude de la membrane, qu'on peut caractériser les composés pectiques. De nature basique, il est très apte à se fixer sar ces substances, tandis qu'il est inerte vis-à-vis de la cellulose et de la callose. Les üssus lignifiés ne sont pas colorés par ce corps, ou ne le sont que faiblement, après l’action des alcalis ou de l'eau de Javel ; néanmoins, comme leur affinité pour le rouge de ruthénium est toujours moindre que pour certains colorants basiques (vert Victoria B, bleu de méthylène, etc.), on peut obtenir, en le combinant à ces substances des doubles colorations du plus bel effet.

Enfin, il a l'avantage de donner, même en milieu acide, des préparations inaltérables, de sorte que les coupes peuvent être déshydratées par la glycérine ou l'alcool et montées ensuile dans le baume, ce qu'on ne peut pas faire avec les matières colorantes artificielles.

Combinaisons salines

Pertr (44) a indiqué, il y a quelques années, un procédé de coloration fort ingénieux, qui consiste à déterminer, dans la membrane, la formation d'un précipité coloré par action successive de deux sels. Devaux (42) a montré, quelque temps après, que ce sont exclusivement les composés pectiques qui retiennent ces combinaisons salines, en raison de la grande affinité qu'ils ont pour les métaux.

Cette affinité est telle qu'elle permet de déceler, dansune solution des traces excessivement minimes d'un métal comme je cuivre ou le plomb. Ces métaux se fixent surtout sur la membrane, mais aussi sur le protoplasme et le noyau.

La cellule devient donc, à son tour, un réactif extrêmement sen-

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sible et précieux des métaux. Des coupes de plantes placées dans une solution de sulfate de cuivre contenant seulement 1 billionième de cuivre métallique, prennent une coloration sensible par le ferrocyanure de potassium (138, 14).

I y a plus, une fois fixés, les métaux peuvent être déplacés Îles uns par les autres. Les métaux alcalins peuvent être déplacés par tous les autres et, en particulier, par le calcium, et inversement celui-ci peut être chassé par les métaux alcalins (14).

Les tissus lignifiés présentent aussi une certaine affinité pour les sels métalliques ; quoique beaucoup plus faible que les composés pectiques, celte affinité se manifeste surtout quand on les a traités au préalable par l'eau de Javel; mais si l'on évite ce lraitement, les parois lignifiées restent ordinairement incolores (15).

Les réactions étudiées par Perir sont les suivantes :

1° Sion plonge une coupe d'organe dans une dissolution de perchlorure de fer, puis, après lavage, dans du ferrocyanure de polassium, le bois reste incolore, la membrane prend une teinte bleue beaucoup plus intense dans le tissu collenchymateux ;

2° Si on remplace le sel de fer par de l’acétate de cuivre, on obtient une coloration rouge ;

3° Si on plonge successivement la coupe dans de l’acétate de plomb, dans de l'eau, dans du bichromate de potassium, les membranes pecto-cellulosiques se colorent en jaune, le bois se colore à peine ;

4° Enfin, réaction extrêmement sensible et qui permet de reconnaître l'existence de membranes en voie de formation, sil'on plonge un üssu végétal dans du perchlorure de fer, puis qu'on le place au-dessus d’un verre de montre contenant du sulfhydrate d’ammoniaque, les tissus jeunes se colorent les premiers en noir, le bois ne se colore qu'ensuite.

Des observations dues à GENEAU DE LAMARLIÈRE (17) et de même nature que celles-ci, ont montré aussi avec quelle facilité les membranes absorbent certains composés minéraux, commé le sesquioxyde bleu de molybdène, obtenu en traitant successivement le phosphate tribasique de calcium par le molybdate d'ammonium en solution azotique etle chlorure stanneux. Il se forme d'abord un précipité jaune cristallin de phosphomolybdate qui est réduit par le chlorure d'étain à l'état d'oxyde de molybdène. La liqueur, d'une

belle couleur bleue, se fixe sur toutes les membranes cellulaires. L'action est énergique pour les membranes pecto-cellulosiques qui prennent une teinte bleu foncé ; elle est beaucoup plus faible pour les membranes lignifiées, subérifiées ou cutinisées qui ne se colorent qu'en bleu pâle.

Les phosphates se fixent aussi de la même façon (phosphate de fer, d'ammonium, phosphate bibasique de potassium, phosphate tribasique de calcium). Il est facile de s'en convaincre en effectuant sur des coupes qui sont restées pendant plusieurs jours dans la solution d'un de ces sels, les réactions qu'on vient d'indiquer pour la préparation de l’oxyde de molybdène. Si les tissus traités par le molybdate d'ammonium, puis parle chlorure stanneux prennent une teinte bleue, c'est qu'ils auront absorbé un phosphate. Or, l'expérience montre que les phosphates se fixent indifféremment sur tous les tissus lignifiés ou non. Ces résullats concordent, sinon d'une façon absolue, du moins d'une façon très approchée, avec ceux de DEvaux et de PETIT.

Bien qu'ils attestent une cerlaine affinité des membranes incrustées par la lignine ou la subérine pour les composés minéraux, ils n'infirment en rien l'hypothèse de Devaux, pour qui la fixation des métaux dans la membrane est due aux composés pectiques. DEvaux, en effet, reconnaît que les tissus lignifiés fixent, quoique faiblement, les sels métalliques, et GENEAU DE LAMARLIÈRE, de son côté, admet que ces mêmes membranes contiennent des composés pectiques (2. c. 195, 48, 158). Que si enfin, les membranes pecto-cellulosiques manifestent, dans de nombreux cas, une affinité plus grande que les autres, c'est que, vraisemblablement, elles contiennent une plus grande quantité de composés pectiques.

TECHNIQUE

Il est souvent nécessaire, pour s'assurer de la présence et de la,localisation des composés pectiques dans une membrane, de les isoler en éliminant la cellulose qui leur est mélangée. On peut, inversement et comme moyen de contrôle, dissoudre les composés pectiques en ne gardant que la cellulose des membranes. En colorant, dans les deux cas, les préparations par les réactifs des composés pectiques, on s'assurera que ceux qui se fixaient dans la première opération ne teignent plus les tissus dans la contre-épreuve. La technique à suivre est celle qu'a indiquée MaNGIx (l €).

Elimination de la cellulose des tissus.

Les coupes minces sont placées dans le réactif de ScHweIzER récemment préparé (1); on les y laisse séjourner plusieurs jours, en renouvelantle liquide toutes les vingt-quatre heures. Si les coupes sont minces, au bout de trois ou quatre Jours, la-cellulose renfermée dans les membranes a été entièrement dissoute, au moins dans les tissus mous ; celle qui constitue les tissus lignifiés résiste beaucoup plus longtemps à l’action du dissolvant.

Quand on juge que la macération est suffisante, on étend d'eau le réactif cupro-ammoniacal et on lave à plusieurs reprises, d'abord à l’eau pure, puis à l'eau acidulée par l'acide acétique (3 à 5 pour 100), de manière à enlever toute trace de sels de cuivre. Si on examine les coupes avec précaution, car elles sont devenues très fragiles, on reconnait que la structure a été entièrement conservée et que les matières azotées ont disparu en grande partie.

La coupe étant traitée par un des réactifs iodés de la cellulose, on constale que les membranes se teignent en jaune. La coloration bleue n'y apparait jamais, sauf dans les tissus lignifiés. Mais si d'autres coupes, après avoir été soigneusement lavées de manière à enlever l'excès d'acide, sont colorées par la safranine, le bleu de méthylène et le rouge de ruthénium, les membranes se Leignent immédiatement, en montrant Lous leurs détails de structure.

Elimination des composés pectiques

Les coupes sont mises à bouillir, pendant une demi-heure, dans l'eau additionnée d'acide chlorhydrique à ? pour 100, ou encore mises à macérer, pendant ?4 heures, dans de l'alcool additionné d'acide chlorhydrique (1/4 d'acide et 3/4 d'alcool).

Si, après lavage à l'eau distillée, pour enlever l'excès d'acide, on essaye, sur les Lissus, les colorants des composés pectiques, on constate que l'acide pectique, qui est insoluble et que l'acide chlorhydrique a mis en liberté {il existait, on le sait, à l'état de pectate de calcium dans la lamelle moyenne), se colore plus fortement que les composés pectiques associés à la cellulose, dans l'épaisseur des membranes propres à chaque cellule, C'est ce ciment d'acide pectique qui maintient accolés les uns aux autres les divers éléments du Lissu.

Mais, vient-on à ajouter une solution d'oxalate d'ammoniaque, dans lequel l'acide pectique est soluble, le tissu est immédiatement dissocié et les membranes ne manifestent plus aucune coloration caractéristique des composés pecliques. ;

(1) V. p. 130 la préparation du réactif de Scaweizer.

EMPLot DES RÉACTIFS COLORANTS

a) MATIÈRES COLORANTES ARTIFICIELLES.

Les substances colorantes des composés pectiques teignant en même temps les tissus lignifiés, il est nécessaire d'employer les méthodes de double coloration, de façon à avoir une élection différente des deux sortes d'éléments. On combinera donc les effets du bleu de Naphlylène R en cristaux et du vert acide JEEE (Poirier).

Le colorant se prépare en dissolvant des poids égaux de ces deux substances dans l’eau pure (1 gramme de chaque dans 100 grammes d'eau). Ce liquide teint en vert les matières azotées, la lignine, la subérine ou la culine, tandis que les composés pecliques sont colorés en violet. Les colorations de la lignine sont surtout très belles si on a soin de traiter au préalable les tissus par une solution de potasse ou par l’eau de Javel, et de laver ensuite soigneusement à l'eau.

Il ne faut pas oublier, en effet, qu'on ne doit opérer qu'en bain neutre. Si le milieu est alcalin, on risque de précipiter les matières colorantes employées sous forme de sels à base faible (la base étant la matière colorante) ; si le milieu est acide, comme l'affinité du colorant est faible, pour les composés pectiques, il sera facilement déplacé de sa combinaison et les coupes se décolorent,

On plongera donc les objets à étudier dans un liquide neutre ou très faiblement acidifié par les acides faibles (acide acélique à 1/2 ou au plus 1 0/0); ou bien encore, on lave les coupes dans l'acide acétique à 3 0/0, et on les passe à l'eau, avant d'ajouter la solution aqueuse du colorant.

De même, après coloration, les préparations ne peuvent pas être montées dans les liquides d'inelusion ordinaires, comme le baume, ni traitées par l'alcool ou la glycériñe, sous peine d'èire décolorées. Seul, l'acide borique ne les altère pas, et employé à ? 0/0 il permettra de conserver les préparations durant des mois entiers.

Les coupes montées dans ce milieu seront alors lutées, pour empêcher l'évaporation, avec un mélange ‘de vaseline et de paraffine, qui s'étend facilement au pinceau.

Le rouge neutre de Cassella, préconisé aussi par MANGiIN, peul même être préféré au bleu de naphtylène dans celte double coloration. Il a sur lui l'avantage d'être très soluble dans l'eau, et de ne pas précipiter ou crislalliser dans les préparations. Il colore les composés pectiques et les mucilages coagulés en jaune orangé el se mélange sans précipitation avec les verts acides. Il est soluble dans l'alcool, la glycérine, les acides qui décolorent les coupes, el il est précipité par les alcalis.

b) RéacrTirs MINÉRAUX. — Rouge de ruthénium [MaNGiN]. (Réactif de choix)

Le rouge de ruthénium a l'avantage de ne pas être soluble dans l'alcool. Il exige done moins de précaution que l'emploi des couleurs d'aniline et donne des préparations d'une conservation à peu près indéfinie.

On l'emploie en solution aqueuse. Il suffit pour cela d'en placer, dans 10 à 15 cc d'eau, quelques cristaux formant le volume d'un grain de millet. La dissolution est très rapide et le liquide prend une belle teinte rose.

Comme la lumière le réduit à la longue, en précipitant probablement du sesquioxyde de ruthénium brun ou noir, il est nécessaire de le conserver dans un flacon en verre noir. Il est même bon de n'en préparer que de petites quantités et de le renouveler dès qu'on y voit apparaître un précipité noir.

Pour colorer les Lissus avec ce réactif, il suffit de les plonger dans une goutte ou deux de la solution: l'absorption de la matière colorante par la membrane est si énergique que le liquide perd une partie de sa coloration.

Les tissus sont lavés à l’eau et les préparations peuvent être conservées dans la glycérine aqueuse ou dans la gélatine glycérinée. On peut même, sans inconvénient, les monter dans le baume du Canada, après déshydratation par l'alcool.

Toutefois, comme les acides décolorent très rapidement les préparations, il ne faut jamais employer le chloroforme comme dissolvant du baume.