CHAPITRE II

La préparation des objets microscopiques, déjà si délicate pour se prêter à de bonnes observations, exige, dans les expériences photographiques, des soins bien autrement minutieux qui en augmentent souvent la difficulté. S’il est presque toujours indifférent au micrographe d’avoir, à côté de l’objet qu’il étudie, des substances étrangères dont il lui est toujours aisé de faire abstraction, il n’en est pas de même lorsque la préparation doit être reproduite par des moyens photographiques qui ne font jamais grâce de rien. Les corps accessoires apparaissent sur l’épreuve aussi bien que l’objet principal, et produisent toujours l’effet le plus désagréable.

De plus, une préparation médiocre suffit, dans bien des cas, à une excellente observation; il est souvent inutile qu’un même objet présente avec une égale netteté les divers détails que l’on cherche à étudier; et le micrographe se fait une idée trèsnette de la structure d’un corps en examinant, sur des individus différents, les portions diverses qui

en constituent l’ensemble. Bien qu’il soit souvent indispensable d’avoir recours en photographie à cette manière de procéder, on devra cependant ne l’employer qu’en dernière ressource et lorsqu’il ne sera pas possible de faire autrement ; mais, avec des soins et surtout de la patience, on parviendra souvent à réunir sur une même préparation toutes les qualités nécessaires à une bonne reproduction : c’est là un point capital, dont la réalisation complète exige, de la part de l’opérateur, une certaine habileté et beaucoup d’expérience.

On trouve, il est vrai, aujourd’hui, dans le commerce, des séries de préparations microscopiques qui ne laissent rien à désirer sous le rapport de leur perfection, et qui conviennent admirablement aux reproductions photographiques ; mais si l’on peut former ainsi, avec la plus grande facilité, des albums d’un grand intérêt, on reconnaîtra que ce n’est pas en cela que consiste l’application sérieuse de la photographie aux études micrographiques, et les services qu’elle est appelée à rendre seraient bien limités , si l’on était toujours forcé d’avoir recours aux mains habiles des préparateurs spéciaux. Aussi, pour bien réussir dans les expériences de cette nature, est-il beaucoup plus indis-

pensable de posséder à fond les connaissances qu’exige le maniement du microscope que d’être initié aux manipulations, cependant délicates, de la photographie. S’il est toujours possible de s’aider des secours d’un photographe habile, on n’obtiendrait jamais que des résultats bien défectueux, si l’on n’était capable d’apprécier d’une manière complète tous les détails qui sont du ressort du micrographe.

Malgré l’importance que l’on doit attacher à la préparation des objets microscopiques, la description détaillée de toutes les méthodes usitées ne saurait trouver ici sa place. Chaque objet exige, pour ainsi dire, un traitement spécial, selon sa nature, et il est difficile d’indiquer à priori des règles générales à cet égard. Il est cependant indispensable de donner sommairement quelques renseignements pratiques, applicables aux cas les plus fréquents, en laissant aux opérateurs le soin d’apprécier les conditions qui conviennent le mieux aux recherches spéciales qui feront l’objet de leurs études.

Les préparations microscopiques s’obtiennent de diverses manières, selon le but que l’on se propose d’atteindre. Les unes, extemporanées, n’exigent que des opérations simples en elles-mêmes; c’est à elles

qu’on a le plus souvent recours dans les recherches de micrographie : elles suffiraient dans bien des cas pour les reproductions photographiques, si elles n’avaient l’inconvénient de s’altérer souvent avec une grande rapidité. Les secondes, destinées à être conservées, nécessitent quelques manipulations plus compliquées, mais sont bien préférables aux premières, en ce qu’elles permettent d’employer indistinctement toutes les dispositions d’appareils qui ont été indiquées dans les chapitres précédents.

Lames de verre. — Quelque soit le mode de préparation que l’on adopte, l’objet sera toujours placé sur une lame de verre qui a reçu le nom de porteobjet. La longueur de ces lames est généralement de 6 à 7 centimètres; leur longueur doit être telle, que chacun de leurs bords puisse être amené au-dessous de l’objectif, sans que l’on soit gêné par la pièce qui supporte le corps du microscope: on leur donne en général de 20 à 30 millimètres. Enfin leur épaisseur sera faible, mais assez grande cependant pour que la lame ne soit pas flexible, ce qui tendrait à déplacer l’objet pendant l’observation. On ne saurait être trop difficile relativement à la pureté des verres destinés à servir de porte-objet; le

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moindre défaut, se trouvant amplifié par l’objectif, donnerait lieu à des taches sur l’image, et si cette condition a de l’importance pour la simple observation, elle est bien autrement nécessaire pour les opérations photographiques.

On doit, en outre, être muni de petites lamelles de verre très-minces, destinées à recouvrir la préparation, et qui, pour cette raison, sont désignées sous le nom de couvre -objet. Elles seront choisies de diverses épaisseurs, selon la longueur focale des objectifs, les plus minces étant destinées aux plus puissants.

Liquides conservateurs. — A l’exception d’un

nombre de cas très-restreint, les objets que l’on

étudie doivent toujours être contenus dans un liquide

qui remplit des usages multiples et dont le choix

est d’une très-grande importance. En premier lieu,

ce liquide ne doit agir, sur la substance qui s’y

trouve plongée, ni par ses propriétés physiques, n

par son action chimique. L’eau pure, par exemple,

exerce une influence d’ordre physique sur les grains *

de pollen qui se gonflent par endosmose, et ne tardent pas à éclater. On choisira, dans ce cas, une liqueur dont la densité soit telle qu’il y ait équilibre

endosmolique entre le nouveau milieu et le contenu de la cellule pollinique. On pourra faire usage, dans ces conditions, d’une solution de gomme arabique, de sucre ou de dextrine -, le sérum du lait, la glycérine, sont également d’un emploi fort utile : mais il est nécessaire de déterminer par quelques tâtonnements la concentration la plus convenable, afin de ne pas produire un inconvénient inverse à celui que l’on veut éviter, une exosmose du liquide intérieur qui aurait pour effet de contracter et de plisser la membrane enveloppante.

D’autres fois un liquide devra être rejeté à cause de l'action dissolvante qu’il exerce sur certains objets ou sur quelques-uns de leurs éléments: c’est ce qui arrive, par exemple, pour les globules sanguins, qui disparaissent rapidement dans l’eau distillée; les acides faibles attaquent plusieurs substances minérales; l’éther et la benzine dissolvent les corps gras, etc. Cependant l’action chimique de ces liquides est souvent utilisée, comme on Je verra plus loin, pour la préparation des objets microscopiques, et rend de fréquents services, en permettant d’isoler aisément des éléments qu’on aurait beaucoup de peine à séparer par des moyens mécaniques.

La seconde condition que doit remplir le liquide

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qui baigne l’objet est de posséder un pouvoir réfringent, à peu près égal à celui de l’objet lui-même. Si l’on observe, en effet, dans l’air un corps trèsréfringent, tel qu’un cristal éclairé par transparence, ses contours paraissent toujours plus ou moins noirs et opaques, à cause delà réfraction qu’il produit et qui exerce sur une partie des rayons lumineux une déviation suffisante pour qu’ils ne pénètrent plus dans l’objectif. Mais si l’on plonge le cristal dans un liquide quelconque, son indice de réfraction sera diminué de celui du nouveau milieu, de sorte qu’un plus grand nombre de rayons efficaces arriveront sur la surface de la lentille; les détails de l’objet paraîtront ainsi plus nets et surtout plus lumineux. On voit, d’après ces quelques mots, qu’à chaque objet conviendra un liquide spécial, et l’expérience seule donnera sur ce point des indications précises. L’eau, les huiles fixes ou essentielles, le baume du Canada, la glycérine, les dissolutions de matières incristallisables, sont employés selon la nature de la préparation, et dans le choix du milieu le plus convenable consiste la plus grande condition du succès.

Au point de vue des reproductions photographiques, celte intluence du liquide environnant a

une grande importance, et devra être étudiée avec le plus grand soin ; elle rend compte de quelques faits assez surprenants au premier abord, et qui trouvent une explication très-simple dans l’action exercée parle milieu qui baigne l’objet.

On observe, en effet, que la préparation d’une substance réfringente, un grain de fécule par exemple, dont les conlours sont très-lumineux lorsqu’on fait usage d’un objectif puissant, donne une image obscure sur les bords lorsqu’on diminue le grossissement. Dans ce dernier cas, les objectifs, se trouvant plus éloignés de l’objet, recevront une plus petite quantité des rayons déviés par le corps transparent, ce qui tient à ce que leur diamètre ne varie pas proportionnellement à la longueur focale, et les bords de l’image seront d’autant moins éclairés, que le foyer de l’objectif sera plus considérable. On voit, d’après cela, que le pouvoir réfringent du liquide interposé devra, pour une même préparation, être d’autant plus grand, que l’on fera usage d’une lentille d’un plus faible pouvoir amplifiant. L’emploi des substances solubles dans l’eau permet d’ailleurs de régler cette influence dans de certaines limites, par la concentration plus ou moins grande des dissolutions.

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Un au Ire avantage de l’emploi des liquides consiste dans la transparence qu’ils communiquent mécaniquement aux objets, et qui en facilite l’observation. Leur action est à cet égard très-variable selon leur nature ,et dépend de la facilité avec laquelle le corps se laisse pénétrer. Toutefois la transparence que la préparation acquiert sous leur influence est essentiellement liée à la cause qui vient d’être indiquée; maison ne doit pas perdre de vue que si, dans la plupart des cas, il convient de la porter à son maximum, il est aussi quelquefois utile de conserver leur opacité à certains objets trop diaphanes. C’est ce qui arrive, par exemple, pour les écailles de plusieurs papillons, pour quelques navicules extrêmement transparentes, dont la reproduction photographique est facilitée par l’emploi d’un liquide peu réfringent ou même par l’observation directe dans l’air. Ce cas est cependant beaucoup plus rare et moins général que le précédent.

Dissection , injections. — Quand les objets qu’il s’agit d’étudier ne se trouvent pas naturellement isolés les uns des autres, il faut avant tout, soit séparer par des procédés mécaniques les divers éléments que l’on veut examiner, soit en obtenir des

sections d’une ténuité suffisante pour qu’elles puissent sc prêter à l’observation. Dans bien des cas, pour les tissus demi-solides, par exemple, il suffit de racler à l’aide d’un scalpel la surface du corps à examiner, et de placer entre deux lames de verre la petite quantité de matière ainsi obtenue ; d’autres fois on enlève un petit lambeau de la substance, que l’on écrase ensuite entre les deux lames sans crainte d’en altérer les éléments. Mais le plus souvent il est utile d’avoir recours à une véritable dissection préliminaire pour isoler les unes des autres les substances que l’on doit particulièrement observer.

Cette opération, qui exige une éducation spéciale, est toujours assez difficile à exécuter, mais elle conduit plus sûrement que toute autre méthode à des résultats certains, rien n’étant alors livré au hasard. La dissection s’effectue sous un microscope d’un faible pouvoir amplifiant, ordinairement à l’aide de simples aiguilles fines ou de petits instruments appropriés aux diverses exigences qui se présentent. Avec très-peu d’habitude on parvient à dissocier ainsi les divers éléments anatomiques des tissus végétaux et à les isoler les uns des autres; mais pour bien des tissus animaux le travail est plus délicat et demande une très-grande habileté.

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On facilite presque toujours la séparation d’organes juxtaposés, par une macération longtemps prolongée clans l’eau pure ou clans les acides étendus : c’est ainsi que l’on parvient à isoler sans peine les diverses couches des tissus végétaux et même leurs organes élémentaires. On verra plus loin combien l’usage de certains réactifs chimiques simplifie encore ces opérations.

Pour apprécier la richesse vasculaire des organes dans lesquels circulent les fluides de l’économie animale, il est indispensable d’user de quelques artifices, susceptibles de rendre les vaisseaux plus apparents par une coloration plus ou moins intense.

Certains liquides, comme le sang, étant fortement colorés, il suffit, de les maintenir clans les vaisseaux, en les coagulant, pour avoir une sorte d’injection naturelle. Une solution étendue de bichromate de potasse jouit de la propriété de conserver la forme et la couleur des cellules sanguines ; mais elle n’agit qu’à une très-faible profondeur dans les tissus, 1 millimètre environ. Ce pouvoir limité n’empêche pas cette substance de rendre de trèsgrands services ; on l’utilise précisément pour des organes qui, à cause de leur ténuité, ne sauraient

être soumis A une injection artificielle, par exemple pour la rate des plus petits poissons, des petits oiseaux chanteurs, de la souris, etc.

Les injections artificielles, nécessaires en anatomie microscopique, seront faites à la main : on se servira de petites seringues de laiton ou de maillechort, munies de canules de formes et de grandeurs différentes. Quant aux liquides qui doivent pénétrer les vaisseaux, voici les formules dont se servent aujourd’hui la plupart des anatomistes, pour les injections bleues et rouges. On obtient une belle couleur bleue soluble, en pulvérisant ensemble, dans un mortier, parties égales d’acide oxalique et de bleu de Prusse : 20 grammes, par exemple, pour 350 grammes d’eau distillée, et on mélange le tout avec une solution de gélatine.

Le carminate d’ammoniaque est généralement usité pour les injections rouges. 2 grammes de carmin dissous dans 200 grammes d’eau distillée, grâce à l’addition d’une petite quantité d’ammoniaque, donnent une coloration très-intense à la solution ordinaire de gélatine.

Les matières colorantes nouvelles, dérivées de l’aniline , seront aussi d’un usage fort avantageux; leur dissolution se fait avec la plus grande

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facilité dans l’eau légèrement alcoolisée ou meme dans l’eau pure, et l’on pourra choisir des nuances, telles que le bleu ou le violet, dont le pouvoir photogénique, plus intense que celui du rouge, se prêtera beaucoup mieux aux reproductions photographiques.

Enfin, il est quelquefois utile de pouvoir étudier dansson ensemble une coupe d’un objet, obtenue dans une direction déterminée. Un grand nombre d’instruments, toujours assez compliqués, ont été indiqués pour pratiquer des coupes d’une épaisseur extrêmement faible, avec une précision mathématique; mais ces divers systèmes tiennent bien rarement les avantages qu’ils promettent, et sont souvent d’un usage incommode. Aussi les micrographes préfèrent-ils l’usage d’un simple rasoir bien tranchant, qui remplace presque toujours ces instruments dispendieux.

Si le corps dont on veut obtenir une section est trop mou, on augmente sa dureté par une macération dans des réactifs spéciaux, dont il sera question plus loin; s’il est très-dur, on fera usage de ciseaux de graveur ou de petits rabots pour en enlever des copeaux; enfin, s’il est d’une consistance suffisante, comme celle d’une tige de bois, l’opération devient

assez aisée. Il est presque toujours plus commode d’effectuer sous l’eau ces sections délicates, qui se font ainsi avec beaucoup plus de facilité. Chaque opérateur se créera d’ailleurs à cet égard une foule de petits moyens spéciaux, parmi lesquels les meilleurs sont toujours les plus simples; mais quel que soit le procédé que l’on adopte, on ne devra pas se dissimuler que, sur un grand nombre de coupes, quelques-unes seulement conviendront aux observations microscopiques , et un bien petit nombre aux reproductions photographiques.

Il est enfin quelques préparations qui, par leur nature, sont au-dessus des ressources dont dispose habituellement le micrographe. Tels sont les coupes très-minces et étendues du tissu osseux, des dents, etc., certains objets destinés aux expériences de polarisation, qui exigent un outillage compliqué et une main exercée à ce genre de travail. Dans ces cas très-limités, il sera préférable, sous tous les rapports, de recourir à l’habileté si connue des préparateurs spéciaux.

Emploi des réactifs. — Il est une autre série de

moyens très-précieux dont on use journellement, et

qui rendent des services de différents ordres ; ils

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consistent dans l’emploi des réactifs chimiques qui, associés aux procédés qui viennent d’être indiqués, augmentent, dans de larges limites, les ressources dont dispose le micrographe. D’une part, en effet, ces agents font naître des phénomènes particuliers qui permettent de découvrir, sous le microscope, la nature de certains principes avec autant de sûreté que le fait le chimiste dans son laboratoire. D’autres fois, ils donnent lieu à des colorations spéciales qui rendent plus visibles telles ou telles substances, trop diaphanes dans leur état normal pour être facilement étudiées. D’autres fois, enfin, ils séparent par leur action dissolvante, certains éléments de principes auxquels ils étaient mélangés, et opèrent ainsi une sorte de dissection naturelle avec beaucoup plus de perfection qu’on ne le ferait par toute autre méthode.

Ces réactifs s’emploient de diverses manières, selon le but que l’on se propose d’atteindre. Dans bien des cas, c’est sur le porte-objet lui-même qu’on les met en contact avec la substance à étudier. La méthode la plus commode consiste à déposer sur le bord du couvre »objet une goutte du réactif, qui ne tarde pas à pénétrer par capillarité entre les deux lames de verre, où elle exerce alors son influence. On

suit ainsi, l’œil sur le microscope, les progrès de la réaction, et on l’arrête à un moment opportun, en appliquant de la même façon une goutte d’eau distillée. Quelquefois cependant l’agent chimique exige, pour produire son effet, soit un contact longtemps prolongé avec la substance, soit l’influence d’une température élevée; il est alors nécessaire de faire subir une macération aux objets avant de les préparer sur une lame de verre. On se sert dans ce cas de petits tubes fermés par un bout, dans lesquels on chauffe le liquide pour augmenter l’énergie de son action.

Une des substances le plus généralement employées est l’acide acétique, qui donne beaucoup de transparence à la plupart des objets qu’il n’altère pas ; il exerce, de plus, sur quelques éléments, une action dissolvante qui en facilite l’élimination dans le cas où ils gêneraient dans une préparation. C’est ainsi qu’il dissout le carbonate de chaux qui incruste souvent certaines végétations aquatiques. Dans l’étude des sédiments urinaires, il est d’un emploi presque indispensable : il permet, en effet, de séparer l’oxalate de chaux, sur lequel il est sans action, du phosphate ammoniaco-magnésien, qu’il dissout facilement ; il transforme les urates

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insolubles, ordinairement amorphes, en acide urique, qui cristallise alors en formes très-élégantes. Enfin, dans les observations relatives aux liquides de l’organisme, il donne un moyen de séparer les globules blancs du sang des globules rouges ; il agit d’une manière spéciale sur les globules de pus, etc.

Parmi les acides minéraux, on emploie quelquefois l’acide sulfurique, qui, suffisamment concentré, carbonise les matières organiques et les rend ainsi plus visibles. L’acide azotique exerce une action spéciale sur les matières albuminoïdes, auxquelles il communique une couleur jaune; il sert également à augmenter la consistance de certains tissus, le tissu nerveux, par exemple, dont il serait impossible d’obtenir des coupes suffisamment minces dans son état normal. L’acide chlorhydrique faible sert à dissoudre les sels calcaires; enfin, l’acide chromique en solution étendue colore en jaune la peau des animaux les plus délicats, les vaisseaux capillaires, etc.

Les solutions alcalines ne sont pas d’un usage moins important : elles agissent sur les matières grasses en les saponifiant, et les rendent solubles dans l’eau ; elles dissolvent les matières protéi-

q ues, et isolent d’une manière très— nette certains éléments anatomiques que la dissection la plus minutieuse serait incapable de séparer. C’est ainsi qu’une liqueur alcaline bouillante détruit avec rapidité la substance organique qui enveloppe les spiculés calcaires des spongiaires et des polypiers, ou les carapaces siliceuses des diatomées ; quelques lavages suffisent ensuite pour obtenir ces corpuscules dans un état de propreté irréprochable. Une solution faible de potasse est aussi d’un usage assez fréquent pour dissoudre les matières amylacées et isoler quelques tissus végétaux sur lesquels elle est sans influence. L’action des alcalis est quelquefois lente à se manifester, et comme ces agents se carbonatent rapidement au contact de l’air, il faut laisser macérer la substance dans de petits tubes de verre bouchés.

La teinture d’iode, ou mieux une solution de ce corps dans l’eau additionnée d’iodure de potassium, est très-souvent employée pour colorer la fécule contenue dans les végétaux; les grains apparaissent alors d’un bleu plus ou moins intense, qui les distingue parfaitement de tous les autres éléments. Le même réactif bleuit la cellulose, lorsqu’elle a été quelque temps en contact avec de l’acide

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sulfurique; enfin il colore en jaune les matières azotées.

Beaucoup de liquides organiques neutres sont également employés dans le but de donner plus de consistance à certains tissus ou de dissoudre quelques-uns des éléments qu’ils renferment. L’alcool durcit et contracte les tubes nerveux; la benzine et l’éther dissolvent les matières grasses, etc. Il est toujours important, lorsqu’on doit faire usage d’un liquide insoluble dans l’eau, de dessécher préalablement les objets, ou de les laver avec un liquide intermédiaire, à Ja fois soluble dans l’eau et dans le liquide employé. L’alcool, par exemple, sert ordinairement d’intermédiaire entre l’eau et l’éther.

On a assez souvent recours à quelques dissolutions salines, soit à cause de l’action qu’elles exercent, soit pour éviter les effets nuisibles de l’eau pure. Le chlorure de sodium, par exemple, rend très-visibles les stries des fibres musculaires. Le phosphate et le sulfate de soude, en dissolution dans l’eau pure ou mélangés à de la glycérine, sont fréquemment utilisés pour l’étude des corpuscules sanguins que l’eau altère très-rapidement. Quelquefois aussi on se sert, pour les études de physiologie animale, du sérum

du lait ou du sang, qui conviennent très-bien pour l’examen des globules organisés.

L’emploi des matières colorantes est aussi d’un très-fréquent usage. Le carmin dissous dans l'ammoniaque est, à cet égard, la substance la plus généralement usitée. Il jouit delà propriété de pénétrer un grand nombre de substances en opérant une véritable teinture ; si, après son action, on entraîne l’excès de carmin par une goutte d’eau, l’objet se trouve coloré en rose et se dessine sur un fond blanc.

On peut tirer un utile parti de cette action pour la photographie, dans un grand nombre de cas où l’objet est trop transparent pour se détacher vigoureusement sur le fond. L’usage du carmin possède cependant quelques inconvénients, auxquels il est facile de remédier en lui substituant d’autres matières colorantes. Sa réaction, nécessairement alcaline, est une cause d’altération pour un grand nombre de matières animales ; de plus, la couleur rouge qu’il communique aux objets est souvent peu favorable, à cause de son faible pouvoir photogénique. Il est alors préférable de se servir des couleurs d’aniline qui donnent facilement des dissolutions neutres ou acides, et dont on peut choisir la nuance,

MÉTHODES OPÉRATOIRES

depuis le rouge le plus brillant jusqu’au bleu le plus pur.

Enfin, dans bien des cas, l’action d’un agent antiseptique sera appliquée avec succès à la conservation de quelques préparations très- altérables. Beaucoup de tissus animaux sont quelquefois détruits avec rapidité, par la naissance d’une multitude de vibrions qui les dévorent; on s’oppose à cet accident par l’emploi du chlorure de zinc ou de l’eau eréosotée. On obtient une liqueur très-convenable en agitant vivement, pendant quelques instants, dans un flacon, avec une petite quantité de créosote, le liquide qui doit servir à la préparation, et en le filtrant ensuite pour séparer la portion qui ne s’est pas dissoute.

Parmi des moyens d’action aussi variés, l’expérience servira de guide pour le choix de ceux qui conviendront à tel ou tel cas ; mais il ne faudrait pas croire que, lorsqu’on aura déterminé les conditions qui se prêtent le mieux à un objet donné, il soit toujours facile d’obtenir du premier coup un résultat satisfaisant. Si, pour certains corps, la préparation s’effectue pour ainsi dire d’elle-même, il est d’autres fois nécessaire d’y revenir à plusieurs reprises avant d’en obtenir une qui réalise les exigences de

la photographie. Le hasard a toujours une assez large part dans le résultat définitif, et si l’habileté de l’opérateur est un des principaux éléments du succès, elle devra toujours être secondée par la patience et la persévérance.

Préparations extemporanées. — Le cas le plus simple qui se présente dans la préparation des objets microscopiques est celui où il s’agit d’étudier des corpuscules en suspension dans un liquide. Il suffit, dans ces circonstances , de déposer sur le porteobjet, une goutte du liquide et de la recouvrir d’une lamelle mince, en évitant d’emprisonner des bulles d’air. Le principal écueil, auquel n’échappent guère les commençants, consiste en ce qu’on obtient souvent une préparation contenant un trop grand nombre d’objets; il est indispensable, pour en bien apprécier la forme et la structure, que chacun d’eux soit complètement isolé de ses voisins; il faut alors ajouter à la préparation une petite quantité d’un liquide convenablement choisi, pour isoler les uns des autres les divers éléments solides. L’eau distillée est ordinairement employée sans inconvénients, mais comme dans quelques cas elle pourrait exercer une action fâcheuse sur la préparation, il est préférable de faire

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MÉTHODES OPÉRATOIRES

usage du liquide lui-même qui baignait la substance à examiner; il suffit d’en filtrer quelques gouttes dont l’addition ne saurait être une cause d’altération.

D’autres fois, le liquide contient trop peu de matériaux solides pour se prêter à une préparation aussi simple; il est alors utile, soit de décanter la liqueur après un repos suffisamment prolongé et de n’examiner que le dépôt, soit d’en filtrer une portion après avoir agité la masse, et de soumettre à l’examen les dernières gouttes qui restent sur le filtre. Cette manière d’opérer est usitée, par exemple, pour l’étude des sédiments urinaires et de la plupart des produits pathologiques.

Toutes les autres substances, qu’elles soient sèches ou humides, sont placées sur le porte-objet et baignées dans un liquide d’un pouvoir réfringent plus ou moins considérable, selon les cas. L’eau pure, la glycérine, l’eau sucrée, l’acide acétique, sont d’un usage général à cet égard; mais si la matière se trouve préalablement imbibée d’un liquide insoluble dans l’eau, on se servira d’essence de térébenthine, d’huile de naphte, d’alcool, etc.

Enfin, dans quelques circonstances peu nombreuses, l’observation peut être faite sans qu’il soit

nécessaire d’avoir recours à un liquide. Les plumules transparentes de quelques papillons, certaines diatomées très-diaphanes, sont dans ce cas. On place ces objets à sec entre les deux lames de verre, et l’on assujettit la lamelle par un fragment de cire ou par tout autre moyen.

Il arrive souvent que le corps à examiner possède une certaine épaisseur qui s'oppose à ce que la lamelle qui le recouvre prenne d’elle-même une position parallèle à celle du porte-objet, de sorte que la couche liquide n’a pas la même épaisseur dans les divers points de sa surface. On éviter cet inconvénient en plaçant dans la préparation des débris d’une matière quelconque, un peu plus épais que l’objet à étudier, tels que des fragments de cheveux ou de fils, de petits morceaux de papier, etc. Mais dans ces cas il est préférable d’avoir recours à de petites cellules que l’on peut construire de diverses manières avec la plus grande facilité.

Le procédé le plus simple consiste à coller sur le porte-objet, à l’aide d’un peu de vernis, de petites lames minces d’étain ou de plomb percées d’une ouverture circulaire ; il est utile d’en avoir de diverses épaisseurs, depuis celle du papier d’étain qui sert à envelopper le chocolat jusqu’à un milli-

220 MÉTHODES OPÉRATOIRES

mètre environ. On forme aussi des cellules trèscommodes, comme on le verra plus loin, en traçant sur la lame de verre, un cercle ou un rectangle avec un vernis plus ou moins consistant, selon la profondeur que l’on veut donner à la cellule. Enfin, des anneaux de verre, coupés au diamant dans un tube et usés sur un grès, fournissent encore un moyen d’obtenir des auges de diverses profondeurs, qui rendent de très-grands services. Il est facile, quand on fait usage de ces instruments accessoires, de s’opposer à l’évaporation du liquide qui baigne la préparation , en enduisant d’un peu de suif le bord supérieur de la cellule, qui se trouve alors hermétiquement close parle couvre-objet.

De même qu’il est quelquefois utile d’éviter de comprimer un objet afin de ne pas altérer sa forme naturelle, d’autres fois, au contraire, il est nécessaire d’exercer sur lui une pression plus ou moins intense, de manière à l’aplatir ou même à l’écraser entièrement. Ce cas se présente, par exemple, dans l’élude de beaucoup d’infusoires, dont les divers organes ne sont rendus visibles que par cet artifice. On a recours pour atteindre ce résultat à un petit instrument qui a reçu le nom de compresseur . Imaginé par Purkinje, cet appareil a reçu depuis son

invention de nombreux perfectionnements qui le rendent aujourd’hui d’un usage très- fréquent et très-commode. La disposition la plus généralement adoptée est celle de Sehieck, qui permet de produire une pression graduelle à l’aide d’une vis appliquée à l’extrémité d’un bras de levier. On modère ainsi à volonté l’action exercée sur l’objet, pour s’arrêter au point convenable en suivant, à l’aide du microscope, les effets de la compression.

D’autres fois, on pourra, par un usage convenable du compresseur, se borner à gêner les mouvements trop rapides de certains infusoires vi-

vants et les réduire à des limites qui ne dépasseront pas celles que peut aborder la rapidité de l’impression photographique. Enfin, il arrive aussi que des corpuscules, inertes par eux-mêmes, flottent dans le liquide qui les baigne à la faveur de quelques substances plus volumineuses qui empêchent le couvre-objet de s’appliquer sur leur surface; c’est ce qu’on observe, par exemple, dans l’examen des grains de fécule, si variables dans leur dimension ; les plus gros sont ordinairement immobiles, tandis que les plus petits nagent librement jusqu’à ce qu’ils rencontrent un obstacle qui les arrête; ici encore le compresseur sera d’une grande utilité.

MÉTHODES OPÉRATOIRES

Le même instrument est appelé à rendre des services d’un ordre tout à fait opposé en permettant , dans quelques circonstances , d’éviter la trop grande compression qui pourrait résulter, pour des objets très-délicats, du simple poids des lamelles de verre. Dans ces conditions, il sera bon d’avoir recours à un modèle spécial construit par M. Nacbet, dans lequel les deux lames conservent une position constamment parallèle. Cette modification a aussi l’avantage de comprimer d’une manière plus sûre et plus régulière les corps un peu volumineux, susceptibles de glisser sous l’influence des compresseurs ordinaires.

La préparation des corps opaques exige beaucoup moins de précautions que celle des objets transparents. Leur dimension, généralement considérable, permet, en effet, de les manier avec plus de facilité, et de plus l’interposition d’un liquide est dans ces cas plus nuisible qu’utile. Il suffit de déposer la substance sur le porte-objet, où on la fixe par une petite quantité d’une matière visqueuse, si son volume est assez grand pour qu’on ait à craindre un déplacement. On la recouvre enfin d’une lamelle mince pour la protéger contre la poussière et les agents extérieurs. Dans ces conditions, l’usage des

cellules, dont il a été question plus haut, sera presque toujours de la plus grande utilité.

Les méthodes qui viennent d’être indiquées sont celles dont les micrographes se servent ordinairement dans leurs recherches; mais elles possèdent plusieurs inconvénients qui les rendent quelquefois insuffisantes pour les opérations photographiques. Le plus grave provient de la mobilité du couvreobjel, qui limite l’emploi de ces préparations aux cas où le microscope conserve sa position normale dans l’appareil photographique. De plus, la chaleur concentrée sur l’objet par le système éclaireur, volatilise en peu de temps le liquide qui le baigne, et la pénétration de l’air entre les deux lames de verre rend la préparation hors de service. On est alors obligé de l’humeeter de nouveau en plaçant une goutte de liquide sur le bord de la lamelle ; mais il arrive presque toujours que l’objet se déplace pendant cette opération, et il faut en faire une nouvelle étude pour trouver le point le plus convenable.

Quelques-uns de ces inconvénients disparaissent cependant par l’emploi de certains artifices. C’est ainsi que l’usage de liquides non volatils, tels que la glycérine ou une solution de chlorure de calcium,

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met à l’abri de l’évaporation. On peut aussi appliquer sur le bord de la lamelle une couche de vernis, dans le double but de la fixer sur le porte-objet et d’empêcher la volatilisation du liquide interposé; mais tous ces moyens ne remédient qu’imparfaitement à ces imperfections, et il vaut mieux recourir au procédé suivant, qui est d’une application tout à fait générale.

Préparations dans des cellules. — Cette méthode consiste à placer l’objet et le liquide conservateur dans une cellule close de toutes parts et dont l’épaisseur est exactement égale à celle de la préparation ; voici de quelle manière on réalise ces conditions. Un des points essentiels est de faire usage, pour la construction des cellules, d’un vernis gras peu siccatif, capable de conserver pendant quelque temps

une certaine viscosité. On obtient un très-bon

vernis en mélangeant une partie de mixtion des doreurs à trois ou quatre parties d’une solution épaisse de bitume de Judée dans l’essence de térébenthine. Ce mélange sera fait par petites quantités à la fois, car il s’altère spontanément et se coagule au bout de peu de temps.

On trace au pinceau sur les porte-objets, à l’aide

de ce vernis, des cercles ou des rectangles de la dimension des lamelles minces que l’on se propose d’employer. Les cellules rectangulaires se font à la main, celles de forme circulaire s’obtiennent plus facilement encore, à l’aide d’un plateau de bois, mobile sur un axe vertical, et qui supporte la lame de verre. On laisse ensuite sécher les cellules pendant vingt-quatre heures au moins avant de s’en servir. Elles se conservent d’ailleurs pendant plus d’un mois sans rien perdre de leurs propriétés.

La préparation s’effectue alors d’une manière fort simple. On place, comme d’habitude, sur le porte-objet, le corps que l’on doit examiner déjà soumis, s’il y a lieu, à l’action des agents chimiques; on riiumectc avec une goutte du liquide qui se prête le mieux à sa conservation et on le recouvre d’une lamelle, ronde ou carrée selon la forme des cellules. Enfin, on soumet le tout à l’action d’une petite presse qui chasse l’excès de liquide et aplatit le vernis jusqu’à ce que l’objet lui-même apporte un obstacle à cette action. La pression que l’on exerce doit être assez faible pour ne pas déformer l’objet ; elle sera toujours assez intense si elle agit pendant longtemps; vingt-quatre heures suffisent ordinairement pour les cas les plus difficiles. Le

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couvre-objet se trouve ainsi fixé d’une manière très-solide et la préparation se conserve indéfiniment sans éprouver d’altération.

11 est cependant d’usage d’enduire le bord de la lamelle d’une couche de vernis au bitume, mais cette précaution est moins nécessaire pour la solidité que pour l’élégance de la préparation.

Quand les cellules sont construites depuis quelque temps, la substance qui les forme n’est plus assez élastique pour céder sous la pression que l’on exerce. On leur rend leur viscosité en les plaçant pendant quelques instants sur une plaque métallique, portée par une lampe à alcool à la température de 50 à 60 degrés, ou en les laissant séjourner dans une étuve modérément chauffée. On augmente aussi l’adhérence du couvre -objet en maintenant dans l’étuve la préparation pendant qu’elle est encore en presse.

Cette méthode fournit d’excellents résultats, et est très-simple dans son application. Elle peut être employée dans presque tous les cas, sauf celui, cependant, où le liquide qui baigne l’objet exercerait une action dissolvante sur le vernis qui forme la cellule ; mais il est toujours facile de remplacer l’essence de térébenthine ou l’huile de naphte, par

exemple, par d’autres liquides jouissant de propriétés analogues.

Préparations dans les baumes et les vernis. — Enfin, il est un dernier procédé, souvent usité dans la préparation des objets microscopiques, et qui a pour base l’emploi des baumes ou de certaines matières résineuses. L’avantage que présentent ces substances dépend de leur grand pouvoir réfringent et de la transparence qu’elles communiquent aux objets. Celles dont on se sert le plus souvent sont le baume du Canada, la térébenthine de Venise et le baume de la Mecque; le vernis à tableau, le vernis copal, etc., sont d’un usage moins fréquent. Les baumes seront d’abord épaissis par une évaporation au bain-marie jusqu’à ce qu’ils aient atteint une consistance cireuse; les vernis s’emploient A l’état liquide.

Quand l’objet est sec et pulvérulent, la préparation en est très-simple, mais lorsqu’il est humide, il doit être préalablement imbibé d’un liquide capable de s’unir au baume par dissolution ; une macération dans l’alcool ou, de préférence, dansl’essence de térébenthine est alors nécessaire. Pour les corps pulvérulents tels que les diatomées , les foramini-

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fères, etc., le moyen le plus simple consiste à les délayer clans un peu d’eau et à déposer ensuite sur la lamelle une goutte du liquide qu’on laisse évaporer, spontanément ou sous l’action d’une douce chaleur. On place alors le porte-objet sur une plaque assez chaude pour fondre un petit fragment de baume que l’on met à sa surface ; il suffit ensuite d’appliquer le couvre-objet et de presser légèrement avec le manche d’un scalpel pendant que la substance se refroidit. La préparation est alors terminée et, au bout de peu de temps, le baume solidifié rend intime l’adhérence des deux lames de verre. Dans beaucoup de circonstances cependant, il est utile d’exercer une pression continue sur la préparation maintenue dans une étuve.

Les préparations dans les vernis ne présentent rien de particulier. Il est seulement indispensable de passer une couche de ces substances sur le bord de la lamelle et de renouveler pendant quelques jours celte opération jusqu’à ce que la dessiccation s’oppose à la rentrée de l’air entre les deux lames.

L’usage de ces moyens convient très-bien aux corps peu transparents ou très-réfringents, mais il est plus nuisible qu’utile pour ceux qui sont trèsdiaphanes; il serait, dans ce cas, quelquefois im-

possible d’observer certains détails qui se voient Irès-bien dans d’autres conditions.

Étude des préparations. — Quand on aura obtenu, par un des moyens qui précèdent, une bonne préparation de l’objet que l’on étudie, il s’agit, avant tout, de déterminer les conditions les plus favorables à son observation. 11 faut d’abord en examiner au microscope toutes les parties, afin d’apprécier le point qui convient le mieux à la reproduction photographique; il est utile, dans celte élude préliminaire , de faire usage d’un faible grossissement qui, en permettant d’embrasser à la fois une grande surface de la préparation, rend cette recherche bien plus facile. On choisit alors parmi les objets les plus apparents quelques points de repère, voisins des parties les mieux réussies, au moyen desquels on pourra s’orienter aisément.

Il est quelquefois très- difficile, lorsque l’objet exige un très- fort grossissement, de retrouver le point souvent unique qui convient le mieux à l’étude ; on évite assez bien cet inconvénient en recouvrant d’un papier noir toutes les parties inutiles de la préparation, de manière à limiter dans un petit espace l’objet qui présente seul de l’intérêt.

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On sc servira également avec avantage d’un petit instrument, désigné sous le nom de revolver porte- objectif , et qui permet de changer rapidement les objectifs pendant l’observation. On montera sur

l’appareil un numéro faible et un puissant; celui qui ne sert pas se trouve relevé de façon à ne pas gêner les manœuvres de l’opérateur.

Dans toutes les dispositions d’appareils qui ont été décrites précédemment, on a pu voir que le microscope était toujours indépendant de la portion destinée à la photographie, de sorte qu’il peut servir tour à tour comme instrument d’observation ou de projection. Le but principal de cette indépendance est précisément d’obvier aux difficultés qui se présentent si souvent dans la recherche de l’objet à reproduire. Il devient ainsi facile d’observer à

Fig. 39. — Revolver porte-objectif.

des deux valets dans la meilleure position, il suffit de remettre en place le microscope sans qu’on ait à craindre aucun déplacement.

Le choix de l’objectif qui doit servir à la reproduction est d’une très-grande importance. 11 ne faudrait pas croire qu’il soit indifférent, pour obtenir par exemple une amplification de 300 diamètres, d’employer un objectif faible en faisant usage d'une longue chambre noire ou d’avoir recours cà un objectif puissant en réduisant la longueur de l’appareil photographique. Le diamètre de l’objet pourra, il est vrai, avoir dans les deux cas les mêmes dimensions, mais les détails de sa structure ne seront souvent visibles que dans le second. Un effet semblable se manifeste pour les observations micrographiques , où les résultats sont bien différents selon que le grossissement est produit par l’objectif ou par l’oculaire.

L’emploi de l’oculaire, de même que l’allongement. de la chambre obscure, amplifie seulement l’image, sans faire naître aucun détail nouveau, que la puissance de l’objectif est seule capable de faire apparaître. Cet effet, dont la théorie rend parfaitement compte, est lié à plusieurs causes et dépend surtout du rapport qui existe entre la distance focale de l’objectif et son angle d’ouverture ;

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on a vu aussi quelle était l’influence de l’indice de réfraction du milieu qui baigne l’objet. En général l’objectif qui convient à la reproduction photographique est celui qui sc prête le mieux à l’observation dans le microscope, mais il vaut souvent mieux faire usage d’une lentille un peu plus faible, surtout lorsqu’on éclaire l’objet par de la lumière monochromatique. On obtient ainsi avec autant de netteté les détails délicats de l’objet et l’on en définit mieux les contours.

Quand il s’agit de reproduire des test-objets extrêmement petits, il est toujours utile, et souvent même nécessaire , d’avoir recours aux objectifs à immersion et de faire usage du svstème de correction dont ils sont ordinairement pourvus. Ce cas se présente dans la reproduction des stries si fines qui couvrent la surface de certaines navicules, mais c’est ici surtout qu’il est indispensable d’employer de la lumière bleue. Les stries des pleurosigma an gulata , elongala , atlenuata , deviennent ainsi visibles avec les objectifs n° h et même n° o de M. Nachet, tandis que dans la lumière blanche l’emploi du n° 7 est presque toujours indispensable. Pour quelques objets plus délicats encore, il faut avoir recours aux deux moyens combinés; les stries du grammalo -

phora subtilissima, qu\ constituent, sans contredit, le test-objet le plus difficile, se voient très-nettement dans ces conditions si l’on a eu le soin de faire un usage rigoureux de la correction.

Enfin, l'éclairage de l’objet doit encore attirer d’une manière spéciale l’attention de l’opérateur. Dans les conditions ordinaires où l’on fait usage de lumière convergente dirigée dans l’axe del’appareil, il suffit, comme on l’a déjà vu, de déterminer la distance focale du concentrateur qui convient le mieux à tel objectif, ce qui peut être fait une fois pour toutes; il ne reste plus alors qu’à s’occuper de la grandeur préférable des diaphragmes, liée, comme on l’a vu, à la nature de la préparation. Le diaphragme placé près du condensateur a peu d’importance et peut être d’une ouverture invariable, mais il n’en est pas de même de celui qui se trouve nu dessous de l’appareil Dujardin; celui-ci devra être d’une dimension appropriée à chaque objectif ou à chaque objet; l’inspection de l’image qui se projette sur l’écran est le seul guide auquel on puisse avoir recours.

L'éclairage oblique est d’un emploi beaucoup plus difficile et exige une grande habitude pour être bien manié. Le degré d’obliquité de la lumière exerce

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une influence énorme sur la netteté des détails que l’on considère, et il existe toujours un point préférable à tous les autres qu’il s’agit de déterminer avec exactitude. Aussi est- il très-difficile de régler la position du miroir en observant l’image qui se dessine sur l’écran, et il est bien plus commode d’avoir recours à un oculaire pour effectuer cette opération. Il n’y a donc rien de particulier à indiquer à cet égard, si l’on adopte une des dispositions d’appareils précédemment décrites pour la production de petites épreuves, mais lorsqu’on devra obtenir directement de grandes amplifications, il est nécessaire d’employer un moyen intermédiaire pour régler la direction de la lumière. Il faut alors supprimer le prisme supérieur destiné à dévier l’image et le remplacer par un oculaire. Tout l’appareil éclaireur étant alors disposé pour l’opération photographique, on cherche, par quelques tâtonnements, l’inclinaison la plus favorable du miroir, pendant qu’on observe l’image avec l’oculaire ; le prisme est ensuite remis en place et il ne reste plus qu'à mettre l’image au foyer sur l’écran, en évitant de rien déplacer dans le système d’éclairage. Il est inutile d’ajouter que l’on doit toujours interposer des verres colorés afin de préserver l’œil d’une lumière trop vive.

MESURE DES GROSSISSEMENTS