XI. Méthode de E. Cordonnier

Préparation de l’histoluol : Dissoudre au mortier 25 grammes de chlorure de chaux dans 250 ce. d’eau. Filtrer après trois heures de contact, laver le résidu avec 195 cc. d’eau. D'autre part, dissoudre 50 grammes de carbonate de soude cristallisé dans 19%5 cc. d'eau. Mélanger les deux solutions. Laisser déposer. Filtrer et compléter le volume à 500 cc. avec de l'eau.

Technique : Dans un flacon, agiter à l’aide de perles de verre le crachat avec la moitié de son volume d’histoluol. Agiter très vigoureusement et si besoin est ajouter de l'histoluol jusqu'à fluidification parfaite: Centrifuger. Étaler le culot. Aucune fixation ne serait nécessaire (??).

L'auteur applique ce procédé à l'urine et aux différents milieux. Pour l'urine, usiter l'albumine de Meyer et Eu le coagulum albumineux à la façon d'un crachat.

Nous signalerons une méthode récente utilisant un produit non encore usité à notre connaissance :

XIL Méthode de Mile Giraud et E. Darrien (1917). (Pyridine).

Dans un verre conique, on mélange avec un agitateur : 10 ce. de crachats avec 15 ce. de pyridine. On laisse en contact jusqu’à fluidification; généralement cinq à dix minutes (?). Centrifuger.

Faire des frollis avec le culot et la pellicule de surface s'il vient à s’en former, ce qui n'arriverait que rarement.

Résumé historique de la question.

Soude. — Parnii les alcalins, le premier usité fut la soude diluée. Telle est la méthode initiale dè Biedert qui atlaquait le crachat par la lessive de soude à 0,2 p. 100 à l’ébullition.

Czaplenski emploie aussi la soude, mais a soin, après la fluidification, de neutraliser à la phénolphtaléine par de l'acide acétique à 10 p. 100 et dilution par de l'eau.

H. Beitzke, reprenant la même méthode, fixe Les doses et les phases de la technique.

Courtade-Arnaude (1902) utilise aussi la soude diluée agissant à l'ébullition sur le crachat, ensuite partiellement neutralisée par l'acide acétique dilué. ;

Carbonates et soude. — Ellermann et Éiandren reprennent la méthode de Biedert, mais commencent par attaquer le crachat par une solution de carbonate de soude à 6 p. 1.000. Ils portent vingt-quatre heures à l'éluve à 37 degrés. Le dépôt décanté est repris par de la soude à 2,50 p. 1.000.

Borax. — À. Kühne agite le crachat à froid avec une solution concentrée de borale de soude. Wendrimer ayant conseillé PORC d'acide borique, Slraus, qui rapporte cette modification, s’y rallie.

Ammoniaque. — Dilg traite le crachat par quelques gouttes d’ammoniaque, puis ajoute un égal volume de NaCI à 25 p. 100 non pas dans un bul fluidifiant, mais pour augmenter la densité du mélange.

, deux Français, de Lannoïseel Girard, Thomas. è

ont les premiers conseillé l’eau de Javelle diluée au tiers. Le culot de sédimentation est repris par V ou VI gouttes de soude à 40 p. 1.000. C'est une méthode en deux temps du genre de la méthode d'Ellermann et Erlandsen, mais en utilisant un hypochlorite. !

Neuf ans plus lard, toute une série d'auteurs semblent ignorer les travaux français et donnent des procédés calqués sur celui cidessus énoncé. L'hypochlorite est lancée dans le commerce sous le nom d'antiformine. Selon les auteurs qui ont analysé ce produit, ce serait une solution d’'hypochlorile de potasse ou desoude. D'après Bezançon et Philibert, l'anliformine donne à froid une homogénéisation parfaite comme l’eau de Javelle d’ailleurs, à chaud en quelques minutes. j ;

Ed. Goodmann a conseillé (1910) la liqueur de Labarraque et plus récemment encore E. Cordonnier (1917) qui dénomme son produit histoluol en en publiant la formule (voir ci-dessus aux exposés des méthodes). .

Ferments digestifs. — Spengler fait digérer le crachat par la pancréatine précédée d'un traitement alcalin à la soude. Jousset emploie un suc gastrique fluoré. Philipp et Jochmann utilisent la fluidification spontanée du crachat à une lempérature favorable. S FRE

Acide phénique. — L'acide phénique a été proposé par Hem-. pel, Van Ketel, Hammond.

Formaline. — La formaline a été proposée par Quensel (1901).

Alcool. — L'alcool préconisé par Strassbürger, 1901.

Pyridine. — Un nouvel agent fluidifiant, la pyridine, a été recommandé récemment (1917), par M'*° Giraud et E. Darrien.

Critiques rapides de l’action des divers fluidifiants.

Nous avons essayé toutes les méthodes ci-dessus énoncées comparativement sur des échantillons de crachats semblables et notoirement tubérculeux. Nous répétons ‘qu’en ce moment nous criliquons uniquement la question fluidification, négligeart volontairement les autres phases que nous apprécierons plus loin.

La soude, premier agent utilisé, ne donne pas toujours des homogénéisations parfaites : son action est fonction de sa dilution. Si Fon met peu de soude (dilution), le crachat n’est pas altaqué entièrement. De plus, on ne peut ajouter une quantité de soude trop considérable, son action caustique et alcaline risquant d'attaquer les bacilles acido-résistants, à la fois, disons-nous, par son aclion caustique et fortement alcaline qui peut d'ailleurs altérer la liqueur de Ziehl ultérieurement ; l'emploi de la chaleur ne fait que compliquer la méthode et augmente les inconvénients ci-dessus énoncés. C’est en partie pour y obvier qu'on a proposé l'intervention d'acide pour neutraliser l’action brutale de la base, Malheureusement, ce pallialif arrive trop tardivement lorsque l'attaque s’est déjà produite énergiquement. ;

Les alcalins plus faibles, carbonates, borax, nous ont paru réaliser Le but cherché : même à froid la fluidification est suffisante pour permettre des étalements finaux parfaitement lisibles quelle que soit la nature du crachatpourtant si variable. On peut, eu outre, avantageusement remplacer l’action de la chaleur par une technique mécanique en agitant dans un flacon bouché, à l'aide de perles de verre, à la façon dont on défibrine les liquides pathologiques.

Point n’est besoin de l’aide d'un acide comme dans les méthodes à la soude pour annihiler partiellement l'action alcaline qui, en l'espèce, est faible. L'acide acétique, proposé comme neulralisant, dissout il est vrai théoriquement la fibrine et ne précipiterait pas l’albumine. \

Toutefois, Straus adopte l'addition d'acide borique au borax qu'il fait agir ensemble puisqu'il prépare une solulion saturée de ces deux produits; l'acide a, de plus, l’avantage d’être faible, de même nalure que celui du sel alcalin.

C’est ce procédé que nous avons adopté pour notre technique spéciale; nous nous sommes assuré que, dans les conditions de l'expérience, notre solution salurée de borate de soude et d'acide borique histolyse très convenablement les crachats même à froid, sans l'adjonetion évidemment d'aucun acide ultérieure-

AY ATX

ment; nous verrons d'ailleurs plus loin la particularité originale de notre méthode à ce sujet.

L'ammoniaque utilisée par Dilg agit bien sur certains crachats peu denses, mais souvent elle donne une homogénéisation visqueuse, filante, ne convenant pas pour des étalements minces.

Malgré notre désir, reprenant l'étude de l'eau de Javelle, nous l'avons abandonnée; elle n'était d'ailleurs pas conciliable avec la deuxième phase de notre méthode. "

La fluidification semble souvent parfaite macroscopiquement, mais ne l’est pas sous l'objectif; il est difficile, même après des filtrations nombreuses, d'obtenir une solution limpide d’hypochlorite. On obtient finalement des élalements épais, abandonnant toujours un dépôt amyloïde, donnant un vilain aspect microscopique. La coloration ou plutôt la décoloralion des froitis est difficile, longue, et la prolongation de-ce temps dans la technique Ziehl-Néelsen peut occasionner une décoloration totale, souvent partielle, des bacilles acido-résistants.

Notre but étant de trouver une méthode rapide, nous avons négligé les méthodes ingénieuses, trop excellentes même ‘de digestion par les ferments diastasiques. On a objecté que les bacilles eux-mêmes pouvaient êlre attaqués.

L'acide phénique a élé proposé, nous ne savons sous quelle idée directrice. Bezançon et Philibert ont vu, comme nous l'avons absolument remarqué nous-même, que non seulement le phénol ne fluidifie pas le crachat, mais encore qu'il Le coagule brutalement, donnant un coagulum (out à fait inutilisable pour des recherches bactériologiques.

Il serait peut-être même ingénieux de recueillir ce précipité el de l’attaquer (à la façon dont on opère en utilisant l’albumine de Meyer).

La formoline est encore d'une utilisation fantaisiste : un très nolable précipité se produit comme il fallait s'y attendre, surtout comme dans la méthode de Quensel, où celte funeste propriété est accrue par l'addition d'alcool à 96 degrés. Même à 90 degrés, l'alcool, en effet, préconisé par Slrassbürger, coagule les albuminoïdes du crachat et on obtient un culot abondant de centri-

fugalion. Et l'auteur recommandait d'ajouter l'alcool pour « faciliter la centrifugalion » |

D’après Bezançon, les alcools plus faibles, 60 ou 50 dégrés, pourraient être utilisés; ils donnent, en effet, un précipité minime ne gênant pas trop.

Enfin, la pyridine, récemment proposée (1917) (sans parler de son odeur inutile à ajouter à celles da laboratoire), ne fluidifie pas toujours parfaitement, donnant souvent un mélange

filant et très difficilement centrifugeable.

La collection des bacilles.

Les différentes méthodes proposées pour la recherche du bacille tuberculeux ont été critiquées par des auteurs évidemment dignes de foi, mais qui, dans leurs recherches de contrôle, n'ont fait que répéter les essais proposés et ont donné leur appréciation globale sur les résultats obtenus. [ls n'ont su scinder ni leurs expériences, ni leur estimation selon les deux grandes phases nécessaires : fluidificalion du milieu et collection des bacilles, de sorte que, quand on lit les résultats des travaux.de ces chercheurs, on a simplement une opinion générale, sans être fixé sur le vice ou l'avantage des différents temps du procédé critiqué.

Nous avons précédemment fait l'étude systématique, expérimentalement contrôlée, des moyens usités pour homogénéiser la prise d'essai, nous avons donné impartialement sur celte phase le résultat de nos constatations, négligeant volontairement l'appréciation du deuxième temps : la collection des bacilles.

Le crachat est donc fluidifié par les différents procédés si nombreux et les bacilles sont répartis dans toute la masse au moment de l'agitation. Si nous abandonnons le tout au repos, il est.vraisemblable que le poids spécifique du microbe interviendra, que l’action de la pesanteur agira pour le précipiter, si possible, au fond du récipient. C’est là l’idée directrice des méthodes de sédimentalion, c'est même l'idée inaugurale des procédés d'enrichissement.

En 1886, dans le Berliner Klinische Vochenschrift, Biedert écrivait :

« Deutschmann avait remarqué que lorsque, après avoir laissé

Aron.

déposer du pus, il inoculait les couches supérieures du liquide, Jamais l'animal ne se tuberculisait; tandis que, en injectant le dépôt, il pouvait révéler sa nature tuberculeuse. Gelte expérience m'a fait présumer que dans les liquides pauvres en bacilles, c'était dans le dépôt formé après un certain temps que les bacilles devaient être le plus facilement décelés ».

Partant de cette base, différents auteurs : Biedert, Kühne, Wendrimer, Slraus, se contenfent de ce mode de séparation, décantant le liquide surnageant et examinant le dépôt. Aman et plus récemment Lœæffler modifient en ajoutant du chloroforme qui gagne le fond entrainant les bacilles. Cette variante fut sans doute apportée parce que la sédimentation se fait parfois difficilement, le crachat souvent mal histolysé ne se déposant qu'imparfaitement et de plus les résultats étant bien inconstants comme nous le verrons.

C'est ce qui explique que Nebel eut l’ingéniosité d'aspirer le liquide à travers une bougie Berkefeld et d'examiner le dépôt des parois après raclage.

L'introduction dans les laboratoires des centrifugeurs mécaniques à fait renoncer à la sédimentation ; la centrifugalion, en effet, permet d'aller plus vite et de collectionner au fond des tubes les parties les plus denses, à la surface Les plus légères.

La plupart des auteurs l'utilisent dans leuis techniques : Beitzke, Spengler, Quensel, de Lannoïse et Girard, Dilg, Ellermann et Erlandsen ct les plus modernes, etc.

En 1902, Courtade-Arnaude pensa qu'en ajoutant à l'homogénéisalion -un liquide léger, l’éther, ce solvant des graisses, serait capable d'attirer les bacilles « gras » comme le bacille de Koch, et les amènerait à la surface du liquide. En 1909, la ligroïne est proposée pour le même usage (Jacobson, Lange, Mitsche) ; en 1900, Koslow ulilise dans le même but un mélange d'éther et d'acétone.

On voit donc que les chercheurs étaient peu salisfaits des différents moyens utilisés qui ne leur donnaient que des résultats inconslants. Sans idée directrice ou presque, on recherche les bacilles tuberculeux tantôt en haut, tantôt en bas. De là l'inégalité des résultats, comme nous allons le montrer.

En 1903 pourtant, Dilg avait essayé de préciser un peu Îles conditions de l'expérience ; par des recherches méliculeuses, il tenta de déterminer le poids spécifique du bacille de Koch. On conçoit la. difficulté’ d'isoler les bacilles qui, même après une histolyse macroscopiquement parfaite, sont souvent adhérents à des cellules, à des déchets quelconques qui les entrainent aussi aisément que s'ils devaient leur précipitation à une densité propre plus élevée. Quoi qu'il en soit, Dilg accuse pour le bacille de Koch une densité — 1.010 à 1.080. Faisons donc remarquer dès maintenant que celte densité est supérieure à celle de l’eau, les crachats étant un peu Dés denses (d’après Bezançon et Philibert).

Dilg, avons-nous vu, fluidifie par l'ammoniaque; si l’on abaisse la densité par de l’eau alcoolisée et centrifuge, on trouve les bacilles dans le culot (Bezançon et de Jong), mais l'auteur les collectionne dans l’eau salée, NaCI 25/100 D — 1.1933, centrifuge et constate que les bacilles sont plus nombreux en surface que dans le culot; lisons bien : il y en a à la fois en surface et dans le culot. :

Il'est évident que le propre poids du-bacille est annihilé en partie par la densité même du véhicule, et selon toute vraisemblance, dans un liquide peu dense, les bacilles gagneraient le fond; dans un liquide dense, la surface.

Bezançon et Philibert ont étudié {out particulièrement la densité du liquide collecteur, et c’est pour cela que dans leur méthode à la soude, ils conseillent d'abaisser la densité au moyen de l'alcool dilué. Leur mélange ainsi obtenu ayant une densité inférieure à 1.010-1.080, ils recueillent au fond,du tube les bacilles tuberculeux.

Dans une thèse de l'Université de Montpellier (1912), Corone (L’homogénéisation des crachats) critique cette affirmation. D'après lui, en effet, l’abaissement de la densité est inutile, les densités des crachats fluidifiés à la soude ne s’élevant pas audessous de 1.007. | 2

Nous empruntons au Traité des crachats de F, Bezançon et S.-[. de Jong le tableau suivant donnant non pas la densité des

crachals, mais la densité des crachats homogénéisés avec les diverses substances :

Densité seule. Homogénéisation.

Lessive de soude diluée à 1 goutte pour 10 cc: 1.000-1.001 0.990-1.004 Borax, acide borique (8 à 12 gr.) saturée ...….. 1.045 1.040 Eau de chaux ..... MAN ST TER CS 1.000 4.000 Bande Jivelle pures 22e. vue... 1 040 1.035 DÉTENTE PSS EE 1.010 1.010 Sol. carb. de soude à 0,6/100....... M a 1.000 1.000

Ammoniaque : Lee :

990 couttes eau. 2842 ve entrant er 1.000 1.000 ANNE LPS OO ee 1.120 au moins. 1.110-1.120 AD HFOPAINE PUNON Pause sert da Poe e 1.120 1.110 Antiformine duuée.-2 2. 20 She ca 1.065 1.060

Il ressort de ce tableau que la densité des diverses homogénéisations oscille entre 0,990 et 1,120.

Nous voyons done que Corone est d'accord avec les constalations du tableau ci-dessus. |

A l'appui de son dire, cet auteur fait les expériences suivantes :

On prépare trois solutions de densités connues :

Solution 1. — Gomme arabique + eau... HE en De h0iS: Solulion 2. — Gomme arabique + eau alcoolisée ..... Di" 010; Solution 3. — Gomme arabique + eau alcoolisée ,.... D'= 986,

On ajoute aux trois solutions des poids égaux de poudre de litharge, on agite. :

On constate, au bout d'un temps donné, que le dépôt formé dans le tube 3 est très légèrement supérieur à ceux des tubes 1 et 2. Ces derniers sont sensiblement égaux.

Conclusion : L'influence de la densité, à peine sensible quand il s’agit de grosses variations (1.015-986), devient à peu près nulle pour les différences minimes (1 015-1.010).

Nous avons répélé les expériences ci-dessus et admettons qu'elles sont exactes. Notons que la centrifugation n'intervient pas, que le liquide a une viscosité due à la gomme arabique et surtout que, vis-à-vis des densités des véhicules (1.015-1.010- 986), la poudre de litharge a un poids spécifique considérable.

MÉTNOT) us

Nous continuons à citer les expériences de l’auteur précédem-

ment nommé :

Influence de la densité des corps en suspension.

1° On agite dans des volumes égaux d'eau pure des volumes égaux des poudres suivantes : litharge, charbon, lycopode.

2° On centrifuge;

3° Au bout d'un temps donné, on constate que c'est la poudre la plus dense qui a été la première précipitée, ce qui est naturel. Les poudres de charbon et de lycopode, bien que plus légères que l’eau, ont été en majeure partie entrainées au fond.

Conclusion : Comme il fallait s’y attendre, le poids spécifique des corps en suspension intervient pour faciliter ou gêner la centrifugation. Mais, et c'est là le fait intéressant, on arrive à centrifuger des corps dont le poids spécifique est de Hhancoupe inférieur à celui qui les tient en suspension.

Ayant repris ces essais peu scientifiques, nous n'avons pas observé les! mêmes résultats : la poudre de lycopode, dont les propriétés vis-à-vis de l'eau sont bien connues (elle s'enfonce dans l’eau lorsque l’enduit cireux des spores est dissous ou manque), est un mauvais témoin; sa densilé d’ailleurs = 1.060, c'est-à-dire plus dense que l'eau. L'épreuve n’est pas de ce fait concluante; de plus, le ch#rbon dans ses pores peut capter de l’eau, à la façon de toute poudre susceptible de s’imbiber; c'est un fait banal à constater : un morceau de bois seç flotte sur l'eau,imprégné de ce liquide, il tombe au fond d'autant plus vite qu'il emprisonne plus d’eau.

Aucune argumentalion n'est donc à lirer de ces essais. Si une parle de la poudre ne tombe pas au fond du tube, c'est précisément parce qu'elle demeure plus légère, ne s’hydratant pas et parce qu'aussi d'autres facteurs que la pesanteur interviennent. On connait le procédé de Haÿ à la fleur de soufre pour la recherche des acides biliaires dans l'urine.

La conclusion est erronée et nos essais nous permettent de la rectifier ainsi :

On n'arrive pas dans un liquide simple, fluide, tel que l’eau, à

SRE TRS

centrifuger des corps « dont le poids spécifique est de beaucoup inférieur à celui du liquide qui les tient en suspension ». Citons encore

Influence de la viscosité. .

1° On prépare dans quatre éprouvetltes des solutions de densités égales et de compositions différentes :

Éprouvelte n° 1 : eau + gomme arabique........ D = 1.004 — NO PEAU ERP INC LME nec D — 1.004 — n° 3 : eau + carbonate de soude... ... D=N00€ — n° 4 : eau + chlorure de sodium, .... D = 1.004

Les deux premiers mélanges sont visqueux.

2° Au même moment, on verse dans ces éprouvetles un poids égal de poudre de litharge;

3° On agite;

4 On surveille de demi-heure en demi-heure les progrès de la sédimentation. On constate que les deux premières éprouvettes (liquides visqueux) restent troubles longtemps après que les deux autres se sont clarifiées.

Conclusion : « La viscosité intervient indépendamment de la densité, dans . sédimentalion des corps en suspension dans les liquides et son action est très sensible », à

Que M. Corone nous permette de dire que ce n'est pas une découverte : la polion gommeuse des pharmacies et certains collutoires glycérinés n’ont pas d’autres prétentions que : de tenir en suspension les produits médicamenteux destinés à être uniformément répartis dans la masse après agitation.

Nous admettons donc évidemment que la viscosité intervient el que son aclion est, en effet, très senstble.

Dans la suite de son ouvrage, Corone critique l'addition d'alcool à l’homogénéisalion à la soude; il constate que la quantité nécessaire pour abaisser la densité dilue trop considérablement les bacilles; il remarque aussi qu'en augmentant la densité par la dissolution de NaCI par exemple (D = 1.030-1.050), on u’a pas de bons résultats en cherchant les bacilles dans le