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borique dans Q. S. eau bouillante;, ajouter encore 4 grammes de borax et filtrer. Ce liquide a, à 15 degrés, une densité D — 1.045. x

Technique :

1° Dans un flacon bouché à l'émeri, mettre un volume de crachat; dissocier avec des perles de verre en agitant vigoureusement; & °

2 Ajouter un égal volume de la solution aqueuse boricoboratée ; agiter cinq minutes et plus jusqu’à fluidification parfaite ; |

3° Ajouter : glycérine officinale un volume égal à celui qui est dans le flacon (crachat + liquide d’histolyse); agiter de nouveau ; e . Æ Dans les tubes équilibrés de la centrifugeuse, verser le” mélange définitif en ménageant une place pour mettre une couche d’éther d'environ 2 centimètres de hauteur: obturer les tubes avec les doigts; agiter; ef

8° Centrifuger le plus longuement possible; avec une centrifugeuse à mains à 1.800 tours, l'opération ne demande généralement pas plus de cinq minutes.

On voit alors le liquide du tube, dans la majorité des cas (si. l'histolyse a été bien faite), sans culot et l'éther nettement séparé à la partie supérieure du tube ayant comme limite une pellicule. ic ae

Avec un fil de platine replié en spirale dans un plan perpen-diculaire à l’axe, on recueille la pellicule et on la dépose sur une lame; avec une autre lame, on dilacère par frottements successifs. Les frottis ont l'air généralement (rop chargés, mais il n'en est rien. On peut, pour plus de sûreté, adjoindre un prélèvement à la pipette du liquide éthéré qui contient aussi des bacilles.

On laisse sécher de préférence à l’étuve.

ILest important d'éviter, en cueillant la pellicule, de plonger trop profondément l'anse qui entrainerait un peu de glycérine el donnerait des étalements luisants et séchant mal. Si ce petit

pts

accident arrivait, n'y prêter que peu d'attention, les manipulations ultérieures élimineront par lavage le corps visqueux.

Fixer comme d'habitude trois fois dans une flamme bleue sans prendre garde à l'aspect luisant que la lame pourrait conserver. 3

Colorer à chaud, suivant la technique Ziehl-Neelsen ou toute - autre. Volontairement, nous négligeons de parler des différentes méthodes de coloration ; toutes peuvent être usilées avec notre procédé. |

Par la technique Ziehl-Neelsen on obtient de très bonnes prépa-. rations où les bacilles apparaissent nets au milieu de très rares déchets cellulaires qui facilitent le repérage des plans.

Comme la théorie nous Le faisait prévoir, nous n'avons pour. ainsi dire jamais trouvé de bacilles dans le culot, même après une longue centrifugation.

Dans le cas le moins favorable à notre procédé, c'est-à-dire

lorsque le crachat à une faible densité, nous pouvons nous rendre compte que malgré tout, malgré l’abaissement de la densité du mélange, agent fluidifiant du crachat, l'homogénéisation, après addition de glycérine, alteint toujours une densité supérieure à celle des bacilles de Koch les plus denses. Si nous reprenôns les-criliques exposées dans la thèse de Corone (/oc. cit.), elles sont un argument ‘en faveur de notre procédé. Le liquide en effet que nous usitons est non seulement un liquide dense dont la nécessité s'impose pour recueillir en surface, mais aussi un mélange visquéux tenanten suspension Îles microorganismes qui n’ont de ce fait aucune tendance à s’isoler dans le culot, même par centrifugation. La facilité de séparation de l’éther (non miscible au véhicule) pour lequel, suivant les idées de Courtade-Arnaude, les bacilles acido-résistants auraient une certaine affinité, entraine le microbe à la surface où il est aisé de le collectionner. |

Un inconvénient allribué à beaucoup de procédés est que, généralement, la fixalion est difficile.

Avec notre technique, nous avons une fixalion parfaite, inmmédiate, par la façon habituelle à la flamme (trois fois à la manière dont on coupe le pain).

Thomas. 3

SA

Il est loisible d'ailleurs de fixer à l'alcool absolu, à l'alcooléther, à l'alcool acélone.

Un autre avantage qui nous fait échapper aux critiques exactes de dilution est que nous ne diluons en somme qu'au quart,

puisque :

CPACDAL EEE Re RE 1 volume.

Liqueur boralée........... 1 »

Evene rc eeceroae 2 »

Dans plusieurs procédés, on dilue d’une manière beaucoup plus considérable (10 fois au moins dans le procédé à la soude), cela nécessite des capacités des tubes centrifugeurs plus grandes ou leur multiplicité. En opérant avec deux tubes de 15 ce. d’une centrifugeuse à main, nous avons une prise d'essai pratiquement suffisante. |

Disons aussi que paf notre technique, qui n'utilise que des agents fluidifiants n’attaquant pas dans les conditions de l'expérience les bacilles acido-résistants (comme on l’a reproché à la soude), on a des préparations normalement colorables avec la réaction spécifique des bacilles de Koch. L'action de l'alcalin n'a pas besoin d'être limitée par l’adjonction d'un'acide quelconque. Notre solution histolysante contient d’ailleurs de l'acide borique ; de plus, dans le processus de notre technique, il se passe avantageusement des modifications. On sait, en effet, que le borale de soude a une réaction alcaline en solution aqueuse et acide en solution glycérique. L’addition de la glycérine change donc la réaction du milieu, la faible acidité de l'acide borique ne peut avoir aucune action ultérieure néfaste.

Comme pour loute recherche habituelle du bacille tuberculeux, il conviendra de suivre une technique usitée pour les bacilles acido et alcoolo-résistants, particulièrement pour le cas de l'urine, du lait, des matières fécales (bacilles du Smegma, du lait, de Mironescu).

Nous croyons devoir donner ici la technique de décoloration récemment proposée par M. Bayard (Bull. de pharmacol., n* 3-4, mars-ayril 1918), Ce procédé s'applique lout à fait bien à notre méthode et nous a fourni des préparations remarquables à tous points de vue.

/ DU Préparer la solution suivante :

Alcool a60 degrés... sr 80 grammes.

Acide borique pur erist.......... OS:

(en excès pour alleindre saturation).

Fillrer au moment du besoin et ajouter :

Glycérine officinale..,.....,..:. 20 grammes.

On recouvre le frollis des crachats avec la solution de Ziehl habituelle et, les premières fumées obtenues, on supprime la chaleur. À ce moment, sans laver la lame colorée, verser une quantité suffisante du réactif glycéro-alcoolique d'acide borique; le liquide devient rouge immédiatement. Rejeter quelques secondes après et verser une nouvelle quantité du réactif; recommencer jusqu'à ce que le liquide qui s'écoule ne laisse plus trace de cette couleur rouge. Finalement, laver copieusement, surtout pour enlever la glycérine qui empêcherait la dessiccation; attendre ce nouvel élat de siccité pour procéder à la seconde coloration du fond au bleu de méthylère.”

Il faut, pour la décoloration, deux à cinq minutes, suivant l'épaisseur de la préparalion quand il s'agit de crachats étalés directement. Avec notre lechnique d’homogénéisation et de collection, l'opération est beaucoup plus rapide et varie d'une demi-minute et moins à deux ou trois minutes. -

On a, par ce procédé, une sécurité absolue, l’action ménagée du liquide décolorant ne risquant pas de dépasser le but cherché; de plus, Le fond coloré au bleu à une teinte nette contrairement à ce qui se produit parfois par l'action des acides minéraux et particulièrement de l'acide azolique qui teinte souvent en jaune sale la préparation.

L'avantage de notre procédé d'homogénéisation et de collection est d'être applicable non seulement pour la recherche du bacille tuberculeux dans les erachats, mais aussi dans tout autre milieu suspect. S

Nous avons pu déceler aisément ainsi des bacilles de Koch

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dans les matières fécales, urines, pus, et dans les liquides pathologiques.

Nous donnerons rapidement la technique appliquée à chaque

milieu.

Application du procédé de l’auteur à la recherche du bacille tuberculeux dans les milieux autres que les crachats. |

La question de la recherche du bacille tuberculeux dans les différents milieux, urine, matières fécales, lait, sang, pus, liquides pathologiques, est intimement liée’à la. recherche dans les crachats. Les conditions sont loujours les mêmes; homogénéiser et collectionner. Aussi les échecs sont dus aux causes que nous avons énoncées précédemment; ils sont imputables, soit à une fluidification imparfaite, soit à un mode de collection erroné.

Nous ne nous étendrons donc pas longuement sur cette question, les criliques déjà faites étant applicables ici même. Nous nous contenterons de donner l'adaplalion pratique de notre procédé à ces recherches particulières.

Dans l'urine. — Il est évident que, dans ce milieu, la fluidifi-.

calion est inutile, les bacilles étant disséminés dans le liquide; nous disons disséminés, la densité de l'urine oscillant entre 1.014et1.028. Si, par centrifugation simple, on a quelque chance de rencontrer les bacilles dans le culot, on ne peut avoir une sécurité absolue et de plus.il serait nécessaire d'opérer sur une quantité considérable. Aussi a-f on imaginé d'entraîner les germes dans un coagulum que l'on traite ensuite comme un

crachat.

C'est en somme à ces deux modes, collection directe et

digestion d’un dépôt artificiel, que sont empruntées ces diffé-

rentes méthodes pour la recherche du bacille de Koch dans

l'urine. Nous citerons les travaux de Bezancçon et Philibert (1908), de Courmont et Mandoul (1904), d'Ellermann et Erdlansen (1908), de Fournier ct Beaufumé (1902), de Guerbet, etc.

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Le procédé bien connu à l'albumine de Meyer est particulièrement applicable à notre méthode ; nous l'indiquerons.

Préparation de l’albumine de Meyer :

Verser un blanc d'œuf dans un flacon de 150 cc. muni de perles de verre; lui ajouter poids égal de glycérine et 1 p. 100! du poids total du mélange, de salicylate de soude dissous dans son poids d'eau. Agiter fortement et filtrer au papier.

Vérifier la réaction acide de l'urine ou l'assurer par quelques gouttes d'acide acétique. S'il n'y a pas d’albumine, ajouter à chaque 100 ec. d'urine 1 cc. d’albumine de Meyer. Chauffer dans une capsule de porcelaine. Agiler jusqu’à ébullition tumultueuse. Jeter sur un filtre sans plis mouillé, entrainer le coagulum sur le filtre. Laver sonmairement avec de l’eau chaude et égoulter. Ouvrir le filtre à plat, l’essorer, racler le coagulum et l'agiter dans un flacon avec des perles de verre en présence de quantité nécessaire de notre solution borico-boratée. Ajouter après fluidification parfaite double volume de glycérine, agiter et centrifuger avec de l'éther. Cueillir la pellicule, la partie éthérée, étaler, colorer. J

Il nous faut faire remarquer que souvent les urines où la recherche doit s'effectuer abandonnent spontanément un dépôt se sédimentant convenablement. Ce précipité a entrainé des bacilles, et il est alors possible de se contenter de traiter ce dépôt par Le liquide borico-boraté, suivant notre technique usitée pour les crachats; tous les temps sont les mêmes. Nous avons pu ainsi déceler nettement des bacilles acido et alcoolo-résistants.

Pour les raisons énoncées précédemment, nous ne trouvons pas qu'il suffise de centrifuger simplement l'urine, cette centrifugation ne risquant que de recueillir des bacilles denses souvent trop rares, peut-être aussi entrainés mécaniquement par des déchets cellulaires. Si l’on veut aller rapidement, il est plus judicieux d'augmenter la densité de l'urine par l'addition de glycérine (deux volumes) et de rechercher les bacilles en surface dans un couche éthérée après centrifugation du mélange.

Dans les matières fécales. —— Comme l'a fait remarquer de Nabias, on ne pratique pas assez souvent la recherche du

bacille de Koch dans les selles. Il s’y trouve cependant fréquemment et permet un diagnoslic certain; le procédé de découverte en est d’ailleurs facile sans avoir recours aux ingéniosités proposées par divers auteurs. Là encore, nous ne ferons que citer des noms, les techniques, toujours basées sur les mêmes principes, ‘apportant les avantages ou les causes d'erreur que nous avons reconnus ailleurs. |

Des travaux intéressants, surtout médicaux, ont été ii sur ce sujet par Anglade (1901), Bezançon et Phuibert (1908), Courmont et Mandoul (1904), de Nabias (1905). QT

Ce dernier indique le processus suivant pour déceler le microbe tuberculeux dans les selles. |

Triturer une certaine quantité de matière avec de l'alcool faible (40 degrés), de force proportionnelle à la fluidité des excreta. Ajouter de l'éther; laisser déposer. On fait un prélèvement sur la couche blanchâtre qui se dépose en surface et on colore par les procédés habituels.

Pour plus de sûreté, nous opérons comme il suit :

Triturer une certaine prise de matière avec notre liquide borico-boralé qui a l'avantage d'attaquer les albumines et certains déchets alimentaires que l'alcool ne fait que précipiter en donnant finalement des préparations peu lisibles. Ajouter de la glycérine double volume, puis de l'éther assez abondamment pour n'avoir pas une solution trop concentrée des corps gras. Agiter et centrifuger. Gomme toujours, on recueille ensurface et on colore normalement.

Cette technique donne toute garantie et l’on est vraiment surpris de la quantité généralement très considérable des bacilles acido et alcoolo-résistants collectionnés.

Dans le lait. — La présence du bacille de Koch dans le lait de femme n'a pas été absolument démontrée. On ne l'a pas trouvé non plus dans le lait de chèvre, d' ânesse et de jument. On a prétendu l'avoir fréquemment rencontré dans le lait de vache, mais il parait vraisemblable qu’il y a eu confusion avec des bacilles acido-résistants relativement assez communs (bacille

he de la fléole des prés, bacille de Müller des graminées, bacille de Corvin).

Il est admis toutefois par Nocard et d'autres auteurs que le bacille de Koch, lorsque la mamelle présente des lésions tuberculeuses, peut envahir Les canaux sécréteurs et passer dans le lait. Contrairement à ce que l'on pourrait supposer le bacille ne se développe pas dans le lait, mais sa présence et sa viru- ‘ lence rendent nécessaire la recherche.

Le lait étant, comme le dit Duclaux, une émulsion de corpuscules gras à la faveur d’un albuminoïde, la caséine, il est vraisemblable que les bacilles demeurent répartis dans toute la masse; la densité du liquide est d’ailleurs voisine de celle qui leur est propre. La dilution considérable a amené à trouver des procédés de collection qui donnent souvent des échecs. La sédimentation simple qui a été proposée n'offre aucune garantie, la crème du lait gagnant la partie superficielle, entraine certainement les organismes qui n’ont aucune raison pour tomber au fond du récipient, bien que le liquide sous Jan devienne plus éclairei, moins émulsionné.

La btoéatos simple du lait ne donne pas non plus des résultats satisfaisants pour des raisons analogues ; la centrifugation n’est qu’une sédimentation rapide.

On à proposé aussi de faire porter l'examen sur les flocons de caséine précipités d'une manière quelconque. Bayard et Cerbelaud indiquent la technique suivante : On traite le lait dans une boule à décantation à robinet (20 à 30 cc.) par 40 à 50 cc. de liqueur ammoniacale d'Adam; on agile, on laisse au repos. La couche supérieure contient tout le beurre, ‘la couche inférieure opaline renferme le sucre de lait, la caséine et les bacilles. On laisse écouler environ 10 cc. que l’on divise dans les tubes de la centrifugeuse, en additionnant chaque tube de 8 à 10 ce. d’eau stérilisée. On réunit les culots dans un seul tube, on ajoute deux volumes d'eau aseplique, on centrifuge de nouveau et on fait des lames avec le sédiment obtenu. Les traces de caséine fixent énergiquement les bacilles.

Procédé de l'auteur. — Nous appliquons aussi notre procédé