ROLE DE L'OXYGÈNE DANS LA RÉACTION MÉTHODES ANAËROBIES

Nous avons vuau Mécanisme de la réaction chap. V, que l’un des facteurs du virage du neutral-rot était la propriété réductrice que possède le colibacille.

Mais cette propriété peut être contrariée par l’oxygène de l’air dans les cultures aérobies. En effet, en quelques minutes le rouge neutre viré et fluorescent prend une teinte rougeâtre si nous ouvrons un tube de culture et si nous l’agitons à l’air.

Rocxaix et Durourr (42) ont d’ailleurs déjà constaté que le colibacille ne fait virer que le haut de la branche verticale des tubes d’'Eijkmann, tandis que le B. subtiles, qui est un aérobie strict, ne fait virer que les couches superficielles.

Il fallait donc chercher à obtenir la réaction en l’absence de l’oxygène de Pair en ensemençant l’eau à analyser en cultures anaérobies.

Cela permettait, d’autre part, d'utiliser le glucose dans le milieu de culture (l’apparition de l’acidité venant de la fermentation du glucose étant retardée

MTS par lanaérobiose) et d’avoir ainsi un élément de plus de diagnostic (production de gaz).

GUERBET (19), d’une part, Fagre-DoMERGuE et R. LEGENDRE (13), d'autre part, se sont occupés de celte question et ont indiqué de nouveaux procédés pour la recherche du colibacille.

Voici la technique de GuERBET :

Dans 1 litre d’eau on fait dissoudre :

Extrait de viande. . 30 grammes Éepionoibree os at 2 50 CHUCOSE REA 50 bu

On alcalinise légèrement à l’ébullition avec une solution de carbonate de soude; on filtre, on ajoute :

Solution de rouge neutre à 0,25 pour 100, 70 centimètres cubes.

En principe, on met 40 centimètres cubes du bouillon de culture pour 100 centimètres cubes d’eau à analyser.

On distribue le milieu dans des tubes, dont la contenance variera avec la proportion d’eau sur laquelle on opère la recherche du colibacille.

GuerBET, dans ses recherches, utilise 30 centimètres cubes d’eau et emploie le dispositif suivant :

Dans un gros tube à essai de O m. 20 de long et O m. 028 de diamètre intérieur on dispose 20 centi-— mètres cubes du milieu de culture, puis on y Jette une petite cloche faite d’un tube à essai coupé (0 m. 040

Verre de long et O m. 022 de diamètre intérieur), de telle manière que l'extrémité fermée regarde en haut. On bouche au coton et on passe à l’autoclave à 115 degrés pendant quinze minutes.

Pendant le séjour à l’autoclave, l’air de la cloche disparaît, de telle sorte qu'après refroidissement du milieu la cloche pleine de liquide est tombée au fond du tube.

50 centimètres cubes d’eau à analyser sont introduits avec une pipette plongeant au fond du tube, afin de faciliter le mélange des liquides même sous la cloche.

On verse ensuite à la surface du liquide 2 ou 3 centimètres cubes d'huile de lin stérile.

L'appareil est porté à l’étuve à 37 ou 40 degrés (il faut que la température soit au moins de 37 degrés); après se1ze ou vingt-quatre heures, rarement trente-six heures, si l’eau renferme du colibacille on constate que la réaction du rouge neutre a eu lieu et que la cloche est remontée à la surface du liquide grâce aux gaz dégagés.

Si, après quarante-huit heures, on n’a pas obtenu à la fois le virage du rouge neutre avec fluorescence et le dégagement de gaz, on peut conclure que l’eau ne renferme pas de colibacille.

Ce procédé possède de réels avantages. Il n’est pas compliqué, est très facile à mettre en œuvre, est très rapide et, d’après GUERBET, est très sûr.

Il favorise la réaction du rouge neutre et permet de rechercher, avec autant de certitude que possible, le colibacille dans les eaux potables.

Nr —

La méthode qu'ont préconisée FABRE-DOMERGUE et R. LEGENDRE est un peu plus compliquée. Elle exige un matériel spécial, mais, par contre, elle a l'avantage de réunir la plupart des procédés d'isolement et de caractérisation préconisés pour la recherche du colibacille : température élevée, culture en milieu phéniqué, culture en milieu glucosé, culture au rouge neutre et, enfin, anaérobiose,

Voici cette méthode :

Le matériel se compose de deux tubes, l’un (le tube à culture) contenu dans l’autre. Le tube à culture remplit presque entiérement son enveloppe et se trouve arrêté, à une certaine distance du fond, par un étranelement limitant un réservoir inférieur où l’on place un mélange absorbant l'oxygène.

Les auteurs obturaient primitivement le tube extérieur par un bouchon en caoutchouc. Ils l’ont remplacé depuis, d’abord par une plaque de verre rodée et scellée, puis, plus simplement, par une fermeture de canette à bière.

Il en résulte donc une atmosphère très limitée, dont tout l'oxygène s’extrait sûrement en même temps que la dépression produite facilite le dégagement des gaz dans le milieu de culture.

La composition du milieu de culture est la suivante :

On prépare un bouillon très nutritif de chair et d’intestin de bœuf peptoné à 2 pour 100 et glycosé à 4 pour 100. Ce bouillon est réparti par doses de 30 centimètres cubes dans des tubes de 20 centimètres de long et de 2 centimètres de large, bouchés assez lâchement à l’ouate et stérilisés à 110 degrés

Fr pendant quinze minutes. Après refroidissement, on additionne les tubes de XV gouttes d’une solution de rouge neutre à 0,50 pour 100, phéniquée à 5 pour 100, en agitant avec une fine baguette de verre stérilisée. Au moment de l’emploi, on ajoute la quantité voulue’ de l’eau à analyser.

Le mélange absorbant, placé dans le réservoir Inférieur du tube extérieur, est un mélange d'acide pyrogallique et de potasse que l’on emploie de la façon suivante : on prépare une solution d’acide pyrogallique à 40 pour 100, préservée de l’oxydation par 5 centimètres cubes d’acide phénique à 5 pour 100. Au moment d'introduire le tube de culture, ensemencé dans son enveloppe, on verse dans celle-c1 10 centimètres cubes de la solution pyrogallique, puis on y fait tomber 5 ou 6 pastilles de potasse caustique.

L’absorption de l’oxygène commence assez tardivement, si l’on n’agite pas, pour laisser tout le temps nécessaire à l’introduction du tube de culture et à sa fermeture avant la réaction utile.

On porte ensuite à l’étuve à 41-42 degrés. Il est prudent de ne pas laisser dépasser 42 degrés et même de se tenir en deçà de cette température, car la réaction du rouge neutre cesse en milieu phéniqué lorsque l’on dépasse cette température.

Au bout de vingt-quatre heures, on obtient un virage du rouge neutre très net, une fluorescence, une production de mousse à la surface, une culture homogène, des ondes soyeuses dans le liquide, si Feau à analyser est cohbacillifère.

Ü y a lieu cependant de faire remarquer, ainsi que

AVE MiqueL l'avait d’ailleurs déjà signalé, qu’il peut se produire quelquefois des cultures pures de Streptococcus pyogenes qui vont gêner ou masquer la réaction. FABRE-DoMERGUE et LEGENDRE ont d’ailleurs rencontré, eux aussi, un streptocoque voisin du S'. pyogenes.

Aussi dans les cas douteux faudra-t-il faire un réensemencement dans le même milieu.

À part cette remarque, la méthode parait sûre et extrêmement sensible, D'ailleurs, ses deux promoteurs l'ont utilisée pour la recherche du colibacille dans les huîtres et en ont obtenu les meilleurs résultats.

Pour la recherche dans les huîtres, au lieu de l’eau à analyser on emploie le liquide retiré d’une huitre et comprenant l’eau de sa coquille et le liquide résultant de la dilacération de son Intestin.

La méthode anaérobie, pour la recherche du colibacille en milieu au rouge neutre, est donc, actuellement, celle à qui l’on s’adressera, car c’est elle qui, orâce à la connaissance du mécanisme de la réaction, permet d'éviter les principales causes d'erreur.