II. — Couleurs simples

1° Procédé de Herxheimer (1). — Cet auteur se sert d’une solution de violet de gentiane saturée à chaud. Les préparations fixées à l'alcool sont maintenues pendant quinze minutes en contact avec le colorant, lavées à l’eau, séchées et montées dans le baume (2).

2° Procédé de Borrel et Burnet (3). — Ce procédé n’est autre que celui recommandé par Lôfïler pour la coloration des cils microbiens. Borrel et Burnet diluent préalablement les produits syphilitiques dans 3 ou 4 gouttes d’eau distillée et déposent sur une lame propre, une série de gouttelettes de cette dilution. Après dessiccation et fixation par la chaleur, on verse sur la lame le mordant de Lôfïler, dont voici la composition :

Solution aqueuse de tanin , à 25 p. 100 10 cent, cubes.

Solution saturée à froid de sulfate ferreux. ... 5

Solution alcoolique saturée de fuchsine 1

On chauffe jusqu’au dégagement de vapeurs, on égoutte et on répète l’opération deux ou trois fois. On colore ensuite par la solution de Ziehl (fuchsine phéniquée),.en chauffant légèrement. Lavage à l’eau ; dessiccation; montage au baume. Les tréponèmes se colorent en rouge vif.

3° Procédé de Proca et Vasilesco (4). — Les préparations sont fixées pendant trente minutes par l’alcool absolu et mordancées à l’aide du mélange suivant :

Acide phénique 50 cent, cubes.

Tanin 40 grammes

Eau 100 cent, cubes.

Fuchsine (solution alcoolique à 2°r,5 p. 100). 100 —

(1) Herxheimer, Münch. med. Woch., 1905, n° 59.

(2) Un léger chauffage facilite la coloration (une minute).

(3) Borrel et Burnet, Comptes rendus de la Soc. de Biologie , 1906, vol. 60, p. 212.

(4) Proca et Vasilesco, Comptes rendus de la Soc. de Biologie , 1905, vol. 58, p. 1044.

TECHNIQUE

Le mordançage dure dix minutes. Lavage à l’eau, puis coloration par le violet de gentiane phéniquè pendant dix minutes.

Violet de gentiane en solution alcoolique concentrée 10 cent, cubes.

Acide phéniquè 5 —

Eau distillée.. . 100 — :

Lavage, séchage, montage dans le baume.

4° Procédé à F argent, Stem (1). — Les frottis de sérosité syphilitique, faits sur lames, sont desséchés à l’air et maintenus pendant quelques heures à 37°. Les lames sont ensuite introduites dans un récipient en verre incolore, contenant une solution de nitrate d’argent à 10 p. 100, et placées à la lumière diffuse. Au bout de quelques heures, les préparations deviennent brunâtres et offrent un aspect métallique ; à ce moment on les retire, on les lave à l’eau et on les dessèche. Il faut éviter d’exposer le récipient à la lumière solaire directe ; dans ces conditions, la réduction s’opère trop rapidement et provoque la formation de précipités. Les frottis traités par ce procédé, montrent des tréponèmes colorés en noir ou en brun foncé (Voy. fig. 19, p. 208); les résultats obtenus par Stern ont été confirmés par Flexner (2), qui a apporté de légères modifications à cette technique.

§ 4. — Coloration du tréponème dans les liquides organiques (sang, liquide céphalo-rachidien, urine, etc.).

Sang. — Lorsque les parasites existent en grand nombre dans le sang, comme il arrive parfois chez les hérédo-syphilitiques, on peut les déceler soit par l’examen direct, soit en se servant de l’ultra-microscope (Hoffmann). Il n’en est pas de même de l’examen du sang des syphilitiques secon-

(1) Stern, Berlin, klin. Woch ., 1Q07, vol. 24, n° 14, p. 400.

(2) Flexner, The Journal of experim. Med., 1907, vol. 9, n° 4, p. 464.

daires, qui ne contient que de très rares tréponèmes. Il est indiqué alors d’employer un des procédés suivants :

a) Procédé de Nœggerath et Staehelin (1). — On mélange environ un centimètre cube de sang pris dans la veine du bras, ou au lobule de l’oreille, à 10 centimètres cubes d’une solution aqueuse d’acide acétique à 1/3 p. 100. Après la dissolution des hématies, on centrifuge et on fait des frottis avec le dépôt. On colore d’après la méthode lente de Giemsa.

b) Procédé de N attan-Larrier et Bergeron (2). — On répartit 10 centimètres cubes de sang puisé dans la veine du bras, dans deux ballons contenant chacun 100 centimètres cubes d’eau distillée stérilisée. Le liquide est centrifugé et le dépôt sert à faire des frottis. On dessèche à 37° et on fixe à l’alcool-éther. Les lames sont plongées pendant vingt-quatre heures dans une solution de nitrate d’argent à 0,3 p. 100; elles sont lavées ensuite avec de l’eau distillée et traitées pendant quinze minutes, par la solution réductrice de Van Ermenghem (Voy. p. 385). Les tréponèmes apparaissent colorés en noir. Rappelons que Ravaut et Ponselle ont appliqué avec succès la méthode à l’argent (Levaditi) à la recherche des spirochètes sur coupes de sang de nouveau-né hérédosyphilitique.

Quant à la coloration des tréponèmes dans le liquide céphalorachidien et Y urine, elle sera appliquée sur des frottis faits avec le dépôt obtenu par la centrifugation préalable de ces liquides. On emploiera de préférence les procédés de Giemsa.

§ 5. — Préparations fixées et colorées sur coupes.

L’extrême ténuité du tréponème et sa faible affinité pour les matières colorantes, font que les méthodes employées couramment en histologie sont incapables de mettre en

(1) Nœggerath et Staehelin, Müncln. med. Woch., 1905, n° 35.

(2) Nattan-Larrier et Bergeron, La Presse médicale, 1906, n° 3, p. 19.

TECHNIQUE

évidence ces parasites dans les tissus syphilitiques. C’est grâce à l’emploi des procédés à l’argent qu’il a été possible de révéler la présence du microbe dans ces tissus. Comme nous l’avons déjà vu, c’est Volpino qui, le premier, eut l’idée d’utiliser les sels d’argent pour la recherche du spirochète dans les diverses manifestations de la syphilis acquise et héréditaire. Son procédé, relativement imparfait, fut dans la suite modifié et amélioré par d’autres observateurs. Cependant nous devons citer, à titre de curiosité, car elle n’est pus pratique, une méthode employée par Herxheimer et Hübner (1), et qui permit de colorer pour la première fois les tréponèmes sur une coupe de chancre. Elle consiste à traiter les préparations par le bleu du Nil , à déshydrater par l’alcool, puis à éclaircir à l’essence de girofle.

Nous possédons actuellement plusieurs méthodes de coloration à l’argent, à la fois simples et fidèles. Les voici :

1° Procédé primitif de Volpino (2). — Des coupes à la paraffine, préalablement montées sur lame et traitées au xylol, à l’alcool et finalement à l’eau distillée, sont maintenues de vingt-quatre à quarante-huit heures dans le bain suivant :

Nitrate d'argent 0&r,50

Eau distillée 100 cent, cubes.

Puis, lavage à l’eau distillée et réduction par le liquide de Van Ermenghem :

Tanin 3 grammes.

Acide galli que 5 —

Acétate de soude fondu 10 —

Eau distillée 350 cent, cubes.

Après un contact d’un quart d’heure, on remet les préparations dans un nouveau bain d’argent, jusqu’à ce que les coupes deviennent brunâtres. Lavage à l’eau. Déshydratation et montage dans le baume.

(1) Herxheimer et Huebner, Deutsch. med. Woch.t 1905, n° 26.

(2) Volpino, R. Accad. di Torino, 14 juillet 1905.

Syphil. expér.

2° Procédé de Levaditi (1). — (Préférable pour la coloration des tréponèmes dans les organes des hérédosyphilitiques).

Des fragments d’organes ayant environ 1 à 2 millimètres d’épaisseur, sont fixés pendant vingt-quatre heures dans du formol à 10 p. 100. Durcissement dans l’alcool à 96° durant vingt-quatre heures, puis, lavage à l’eau distillée jusqu’à ce que les fragments tombent au fond du récipient. On plonge alors les tissus dans la solution suivante (bocaux hermétiquement fermés avec bouchon en verre et très propres) :

Nitrate d'argent 16r,5 à 3 grammes.

Eau distillée 100 cent, cubes.

On maintient les récipients pendant trois jours à 38° et à l’obscurité. Lavage à l’eau distillée et réduction par le mélange suivant (Ramon y Cajal) :

Acide pyrogallique

Formol

Eau distillée

4 grammes.

5 cent, cubes.

La réduction dure vingt-quatre heures.

Ensuite, déshydratation à l’alcool absolu, xylol, puis coupes à la paraffine (5 ^ au maximum). Enfin, coloration par l’un des procédés suivants :

Giemsa. — Les coupes sont traitées par le mélange de Giemsa non dilué pendant quelques minutes, puis lavées à l’eau et différenciées avec de l’alcool absolu, auquel on ajoute quelques gouttes d’essence de girofle. Éclaircissement à l’essence de bergamote; xylol, baume, etc.

Bleu de toluidine. — Coloration par une solution concentrée de bleu de toluidine, différenciation à l’alcool additionné de quelques gouttes du mélange éther-glycériné d’Unna, éclaircissement à l’essence de bergamote ; xylol, baume, etc.

Rouge neutre — bleu de méthyle (Manouélian). — Les coupes sont traitées tout d’abord par une solution à 1 p. 100 de bleu de méthyle, puis lavées à l’eau. On colore ensuite avec une solution de rouge neutre à moitié saturée, et on différencie à l’alcool absolu; xylol, baume, etc.

(1) Levaditi, Comptes rendus de la Soc. de Biologie , 1905, vol. 49, p. 326.

TECHNIQUE

3° Procédé de Levaditi et Manouélian (1) (Préférable pour la coloration des tréponèmes dans les tissus syphilitiques biopsiés).

Fixation des fragments de 1 à 2 millimètres d’épaisseur dans une solution de formol à 10 p. 100 pendant vingt-quatre ou quarante-huit heures. Durcissement par l’alcool à 96 degrés pendant vingt-quatre heures. Lavage à l’eau distillée jusqu’à ce que les fragments tombent au fond du récipient. Impré-

gnation par la solution suivante :

Pyridine 10 cent, cubes.

Solution de nitrate d'argent à 1 p. 100 (eau distillée) 90 —

Les bocaux, hermétiquement fermés, sont maintenus à la température de la chambre pendant deux heures, et à 50- 55 degrés (2), pendant trois à cinq heures (cette durée varie suivant l’épaisseur et la perméabilité des tissus). Lavage à l’eau distillée et réduction par le mélange suivant :

Pyridine 17 cent, cubes.

Acétone 10 —

Solution d'acide pyrogallique à 4 p. 100 dans

de Veau distillée 90 —

On maintient le contact pendant quelques heures; suivent

le traitement par l’alcool, le xylol et l’inclusion à la paraffine (coupes de 5 \x au maximum).

Coloration des coupes au bleu d’Unna ou au bleu de toluidine et différenciation à l’aide du mélange éther-glycériné d’Unna.

jLes parasites apparaissent en noir, les tissus en jaune pâle (Voy. Planche II, fîg. 2).

4° Nouveau procédé de Bertarelli et Volpino (3). — Les fragments de tissus fixés à l’alcool à 96°, sont plongés pendant quatre jours dans un bain de nitrate d’argent ayant la composition suivante :

(1) Levaditi et Manouélian, Comptes rendus de la Soc. de Biologie , 1906, vol. 60, p. 134.

(2) Étuve à paraffine.

(3) Bertarelli et Volpino, Centralb.für Bakteriolog., 1906, vol. 41, fasc.I,p.74,

Nitrate d'argent. . .

Eau distillée

Alcool à 96 0

Acide acétique pur.

50 cent, cubes.

IV à Y gouttes.

Lavage à l’eau distillée et réduction par le réducteur de Van Ermenghem (Voy. p. 385).