RECHERCHE DU TREPONEMA PALLIDUM SUR FROTTIS ET SUR COUPES

La recherche du Treponema pallidum dans les divers produits syphilitiques est entrée dans le domaine de la pratique depuis qu’on a établi le rôle de ce parasite dans la genèse des manifestations spécifiques, et par suite son importance au point de vue du diagnostic de la vérole. Différents procédés ont été recommandés pour le mettre en évidence ; notre but est de les étudier successivement, en insistant sur ceux qui sont à la fois les plus simples, les plus fidèles et les plus rapides (1).

On peut rechercher le spirochète soit sur des frottis de produits spécifiques (chancres, papules, suc ganglionnaire, etc., etc.), soit dans des liquides organiques (sang, urine, liquide céphalo-rachidien), soit enfin sur des coupes de tissus syphilitiques. L’examen se fait sur des préparations fixées et colorées, et aussi sur des préparations fraîches. Avant d’aborder l’étude de chacun de ces procédés en particulier, nous insisterons sur la technique du prélèvement des produits à examiner.

(1) Certaines parties de ce chapitre ont été reproduites d’après un travail publié par Levaditi dans la Revue de médecine (1907, vol. 27, n° 10, p. 940).

| I. — Prélèvement du matériel.

Le prélèvement des produits spécifiques est un des temps les plus importants de la préparation. De lui dépend, en grande partie, le succès de la recherche du tréponème; l’inconstance des résultats obtenus au début, tenait, en effet, bien plus à une mauvaise technique dans ce prélèvement, qu’à la rareté des spirochètes, ou à l’insuffisance des procédés de coloration. Cette opération doit donc être faite très soigneusement et être guidée par nos connaissances sur les rapports entre le parasite et les tissus.

C’est dans les couches profondes de l’épiderme et principalement dans le corps papillaire du derme , qu’on décèle plus facilement le Treponema pallidum ; c’est à ce niveau également qu’il y a le plus de chances de le rencontrer à l’état de pureté presque absolue. Il est établi actuellement, comme nous l’avons vu dans la troisième partie de cet ouvrage, que les parasites se multiplient de préférence à la périphérie des vaisseaux sanguins et lymphatiques, ainsi que dans les fentes qui séparent les fibrilles du tissu conjonctif. Il en résulte que la sérosité qu’on fait sourdre de la profondeur du derme soit par grattage, soit par une irritation quelconque, renfermera de nombreux spirochètes, surtout si l’opérateur a soin de procéder doucement et de ne pas provoquer d’hémorragie.

Ce liquide séreux, nommé Reizserum par Hoffmann, rosée séreuse par certains auteurs français (Thibierge, Nicolas), est généralement pauvre en éléments anatomiques et par conséquent facile à examiner. Il s’écoule aisément si on comprime les tissus d’une façon intermittente.

On se servira d’instruments stériles et on aseptisera autant que possible la région, sans cependant trop l’irriter. Si les téguments sont intacts, on pratiquera un décapage au savon, suivi d’un lavage à l’alcool et à l’éther, ou simplement à l’eau salée isotonique. Si l’accident présente une surface

TECHNIQUE

couverte de squames, on les enlèvera et on nettoiera le fond de l’ulcération à l’eau bouillie ou à l’eau salée, de façon à mettre le derme à nu et à le débarrasser des produits qui le recouvrent. Enfin, pour prélever le plus grand nombre de parasites, on a recommandé certains procédés (excision, grattage, vésication, ponction, etc.), que l’on emploiera de préférence suivant qu’on pratiquera une ablation partielle ou totale, suivant qu’on voudra faire transsuder un peu de sérosité de l’intimité des tissus, suivant surtout la nature de la lésion qu’on désire examiner (1).

Le chancre est justiciable de l’ablation totale, de l’excision partielle, ou, le plus souvent, du grattage simple de sa surface. Le premier procédé, utile si l’on veut faire des coupes, est peu employé, car il est douloureux et a l’inconvénient de nécessiter l’incision de nombreux vaisseaux qui sont autant de voies ouvertes à l’infection. Le mode le plus habituel de l’excision partielle consiste à faire porter l’incision sur la totalité de la lésion, en la dirigeant parallèlement à la superficie. De cette façon, l’érosion chancreuse ne peut contaminer la surface de section, destinée soit à faire des frottis sur lame, soit à être soumise au raclage. La méthode la plus pratique est celle du grattage) si on est en présence d’une lésion sèche , on en gratte la surface avec une curette tranchante, ou avec un vaccinostyle. On voit bientôt sourdre des gouttelettes de sérosité et le suintement s’établit définitivement. Si l’accident est ulcéreux et recouvert de croûtes, on aura soin de bien nettoyer sa surface et de mettre à nu le derme, au niveau duquel on pratiquera le même grattage, ou on prélèvera quelques fragments de tissu.

L’examen des taches de roséole et des papules peut être fait

(l)Tout récemment. Zabolotny ( Congrès <T Hygiène de Berlin, septembre 1907) a recommandé l’emploi d’un procédé qui permet d’obtenir du suc de chancre ou de papule très riche en tréponèmes ; il consiste à scarifier légèrement la surface et à appliquer une ventouse de Bier.

après scarification, ou bien après l’emploi d’un vésicatoire (Levaditi et Petresco). Ce dernier procédé consiste à poser un petit vésicatoire cantharidien sur la surface des lésions cutanées et à recueillir le liquide accumulé dans la phlyctène après six à huit heures de contact. Ce liquide sert à faire des frottis que l’on colore d’après la méthode de Giemsa (1).

La recherche des tréponèmes dans les ganglions correspondant au chancre est plus délicate. L’extirpation, suivie d’incision et de prélèvement à la surface de section, est un procédé peu pratique et auquel on ne devrait pour ainsi dire jamais recourir. La ponction, méthode préférée de Schaudinn et Hoffmann (2), est le moyen le plus simple; il consiste en une aspiration aseptique du suc ganglionnaire à l’aide d’une seringue de Pravaz stérilisée, pourvue d’une aiguille à large ouverture. On évitera autant que possible le mélange du sang ou de particules de tissu ganglionnaire à cette sérosité. D’ailleurs, la ponction n’est pas exclusivement réservée aux ganglions ; elle fut encore appliquée, il est vrai rarement, à l’examen des papules (Herxheimer et Hübner) et des gommes ramollies. Cependant, comme l’a montré Lipschütz, le liquide gommeux étant un produit de dégénérescence, il ne contient pas de parasites; c’est dans le fond et les parois de la gomme qu’on les rencontre le plus souvent. Aussi, lorsqu’on aura à faire des recherches sur une gomme à l’état de crudité, le moyen le plus sûr sera de l’inciser et de prélever un peu de tissu sur la paroi.

| 2. — Préparations fraîches.

C’est en examinant à l’état frais du suc d’accident primaire, sans fixation, ni coloration, que Schaudinn a vu pour

(1) Flexner recommande de provoquer la vésication au moyen de l’ammoniaque {The medical News, décembre 1905).

(2) Schaudinn et Hoffmann, Deutsch. med. Woch., 1905, n° 18.

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la première fois le Treponema pallidum. Ce procédé a l’avantage d’être rapide et de fournir des renseignements sur la réfringence, la mobilité et la vitalité du parasite. Cependant, l’extrême ténuité du microbe, sa grande fragilité et surtout sa faible réfringence rendent ce genre de recherche assez difficile; il nécessite, en effet, une grande habitude de l’œil. Si le liquide est assez clair, on peut l’examiner soit en goutte pendante, soit entre lame et lamelle. Mais, si la partie prélevée est solide, ou si le suintement est trop épais, on l’examinera après l’avoir dilué ou dissocié dans une solution saline isotonique. On aura soin de faire cet examen aussitôt que possible après le prélèvement. La technique suivante nous paraît la meilleure :

On dépose une gouttelette de la lymphe qui s’écoule à la surface du chancre, entre une lame et une lamelle et on examine immédiatement à l’aide d’un éclairage artificiel, de préférence le bec Auer (oculaire compensateur 8, objectif 12 à immersion de Zeiss). On réussit ainsi à distinguer les tréponèmes, surtout si on les cherche dans les parties de la préparation où il y a peu de cellules et de débris cellulaires.

L’emploi de Y ultra-microscope ( éclairage latéral ), recommandé récemment par Landsteiner et Mucha (1), a beaucoup facilité la decouverte des spirochètes à l’état frais.

Voici les détails du procédé dont se sont servis ces auteurs :

Mode d'emploi de V ultra-microscope (2). — Le dispositif se compose d’une source lumineuse, d’un condensateur spécial et d’un statif de microscope, muni d’un objectif à sec ou à immersion, et d’un oculaire compensateur (fig. 58).

La source lumineuse est un arc voltaïque de 20 ampères, à réglage automatique, ou une lampe de Nernst, ou enfin

(1) Landsteiner et Mucha, W iener klin. Woch., 1906, n° 45.

(2) Zeiss et Leitz ont fabriqué des appareils se rapprochant de celui que nous décrivons. On trouvera la description détaillée de l’ultra-microscope de Leitz- Gogit, dans le travail de Gastou ( La Presse médicale, 1908, n° 30, p. 237). Les figures reproduites ci-dessus nous ont été fournies gracieusement par M. Gastou.

un fort bec Auer. Une lentille convergente permet de diriger les rayons vers le miroir du microscope.

Le condensateur (fig. 59, c), que l’on peut appliquer sur un statif ordinaire, est constitué par un disque en cristal taillé en cône tronqué, au-dessous duquel vient se placer un autre disque métallique noir ; ce dernier masque une

Fig. 58. — Dispositif du microscope à éclairage latéral. Système Leitz-Cogit.

{D'après Gastou.)

partie seulement de la surface du condensateur et ne laisse passer vers l’objectif que des rayons obliques.

Grâce à ce dispositif, l’objet placé sur le condensateur n’est éclairé que latéralement et repose sur un fond noir ; il est blanc et brillant, et se détache nettement sur le fond sombre du champ microscopique.

Mode d'emploi. — Une goutte de sérosité provenant de lésions syphilitiques, est diluée avec de l’eau salée et déposée entre une lame spéciale et une lamelle, de façon que la couche de liquide soit uniforme et dépourvue de bulles d’air. La lame, plus épaisse que d’ordinaire, est taillée en cristal ; on la nettoiera soigneusement avant de s’en servir, en la couvrant d’une couche de collodion, qu’on enlèvera au

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moment où la dessiccation est presque complète (Mouton). On évitera l’évaporation du liquide à examiner, en bordant la lamelle d’une couche de vaseline.

La lame est ensuite placée sur la platine du microscope, après avoir déposé quelques gouttes d’huile à immersion sur le condensateur. En exerçant une légère pression sur la lame, on étale l’huile, tout en ayant soin d’éviter les bulles d’air.

L’examen est fait tout d’abord avec un petit grossissement. En déplaçant le miroir du microscope, on réussit à cen-

Fig. 59. — Condensateur permettant l’éclairage latéral. Système Leitz-Cogit. {D'après Gastou.)

trer le foyer lumineux, qui apparaît comme un cercle clair à la surface de la lamelle. On recherche ensuite le tréponème en se servant d’un oculaire compensateur 18 et d’un fort objectif à sec (n° 7 de Reichert, par exemple). Le parasite, blanc et brillant, montre des ondulations régulières et laisse voir des mouvements latéraux et de progression. D’autres fois il se présente comme un fdament mince, irrégulièrement ondulé, ou encore comme une ligne en zig-zags (Voy. fig. 7 et 8, p. 157). Il est en général facile à différencier du Spirochæta refringens , dont les mouvements sont plus rapides et les tours de spires plus larges. L’aspect brillant du tréponème, contrastant avec le

fond noir de la préparation, facilite beaucoup la recherche du parasite de Schaudinn dans les produits spécifiques (1).

| 3. — Préparations fixées et colorées sur frottis.

La coloration des tréponèmes sur frottis peut être réalisée soit avec des mélanges colorants, soit avec des solutions monochromiques. Les premiers sont préférables lorsqu’on désire étudier les détails de structure du parasite et ses rapports avec les éléments cellulaires; les secondes permettent de colorer rapidement le spirochète et sont plus avantageuses lorsqu’on se propose de faire le diagnostic rapide d’une lésion présumée spécifique.

I — Mélanges colorants.

1° Procédé lent de Giemsa (2). — Pour obtenir des préparations irréprochables, il est nécessaire de faire les frottis soigneusement et de bien fixer avant de colorer.

Les frottis seront faits sur lame ou sur lamelle. Une goutte de la sérosité claire qui s’écoule après le grattage du chancre, sera déposée sur une lame et étalée en couche mince et uniforme. S’il s’agit de particules solides, on les écrasera entre deux lamelles, en les délayant dans un peu d’eau salée.

La meilleure fixation est la fixation par l’alcool méthylique ou par l’alcool absolu. On verse dans un petit cristallisoir une certaine quantité d’alcool et on y plonge les lames ou les lamelles après séchage à l’air ; on couvre et on laisse en contact pendant une demi-heure ou plus.

On se sert ensuite d’un mélange .colorant composé de bleu azur, d’éosine, de glycérine et d’alcool méthylique, mélange préparé par Grübler et étiqueté : Giemsafs

(1) Les constatations de Landsteiner etMucHA ont été confirmées par Hoffmann et Beer, Berl. klin. Woch., 1907, n° 12.

(2) Giemsa, Centralb. fiir Bakteriolog., 1905, vol. 36, fasc., II p. 308; Deutsih . med. Woch., 1905, n° 26, p. 1026.

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Lôsung fur die Romanowsky-F àrbung. En voici la constitution exacte :

Azur II — Éosine 3 grammes.

Azur II (1) 0,8 —

Glycérine (Merck, chimiquement pure) 250 cent, cubes.

Alcool méthyli que 250 —

Au moment de l’emploi, on dissout environ 15 gouttes de ce mélange dans 10 centimètres cubes d’eau, on verse le contenu dans une boîte de Pétri et on y introduit les préparations. Après un contact de plusieurs heures, on lave à l’eau, on sèche sur papier fdtre et on monte dans le baume.

2° Procédés rapides de Giemsa.

a) Méthode au carbonate de soude. — On verse dans un verre à pied 10 centimètres cubes d’eau distillée et 5 à 10 gouttes d’une solution à 0,1 p. 100 de carbonate de soude. On ajoute, en ayant soin d’agiter le liquide, 10 gouttes du mélange colorant de Giemsa. La coloration dure de trois quarts d’heure à une heure.

b) Méthode par le chauffage (2). — Giemsa a récemment modifié le procédé proposé par Preis (3), basé sur l’emploi de la chaleur; il a réussi à rendre plus rapide la coloration des tréponèmes sur frottis. Voici comment il opère :

a) Frottis. — Les frottis sont faits sur lame et non pas sur lamelle ; la couche sera aussi mince que possible.

(3) Fixation. — Il n’est pas nécessaire de fixer les préparations faites depuis un certain temps; la simple dessiccation suffit dans ce cas. Les frottis frais seront fixés en les passant trois fois par la flamme d’un bec de Bunzen à moitié ouvert, ou d’une lampe à alcool.

y) Coloration. — La substance colorante sera préparée en

(1) U azur II est un mélange d 'azur de méthylène et de bleu de méthylène à parties égales.

(2) Giemsa, Deutsch. med. Woch., avril 1907, p. 662.

(3) Preis, Soc. médic. de Budapest, décembre 1905.

versant 10 gouttes du mélange de Giemsa dans une éprouvette graduée contenant 10 centimètres cubes d’eau distillée, en ayant soin d’éviter la moindre trace d'acide. On empêchera la formation de précipités en se servant de récipients très propres et en agitant doucement l’éprouvette pendant qu’on laisse tomber une à une les gouttes de couleur. Le mélange ne sera d’ailleurs préparé qu’au moment même de l’emploi. Giemsa recommande de renforcer le pouvoir colorant en ajoutant 5 à 10 gouttes d’une solution de carbonate de soude à 1 p. 1000.

La coloration sera faite de la façon suivante : on maintient la lame chargée de produits syphilitiques à l’aide d’une pince appropriée et on y dépose quelques gouttes du mélange colorant. On chauffe pendant quelques secondes au-dessus de la flamme d’un bec de Bunzen à moitié ouvert, jusqu’au dégagement de vapeurs, en évitant l’ébullition. On jette ensuite le liquide et on le remplace par une nouvelle quantité de couleur. On chauffe à nouveau pendant quelques secondes et on répète une dernière fois l’opération. Faire durer le dernier chauffage pendant une ou deux minutes. On lave à l’eau, on dessèche sur papier fdtre et on fait l’inclusion (baume de Canada et lamelle).

Dans les préparations traitées par ces procédés, les tréponèmes apparaissent colorés en violet rougeâtre. La première méthode est préférable lorsqu’on désire étudier les détails de structure, les rapports entre les parasites et les éléments cellulaires, etc.

3° Procédé de Marino (1). — Ce procédé est, avec ceux de Giemsa, le plus employé. On se sert d’une couleur bleuo préparée par Marino et qui est fournie à l’état de poudre (2).

(1) Marino, Annales de V Institut Pasteur , 1905, vol. 19, p. 351.

(2) Préparation de la poudre de Marino :

Bleu de méthylène 0"r,50

Bleu azur 0gr,50

Eau 100 grammes.

Cette solution est mélangée à parties égales avec une solution de carbonate de soude à 0,50 p. 100. Après un séjour de vingt-quatre à quarante-huit heures

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La solution colorante s’obtient en dissolvant 0gl’,04 de cette poudre dans 20 centimètres cubes d’alcool méthylique pur ; on verse sur la lame non fixée quelques gouttes de cette solution et on prolonge le contact pendant trois minutes. Ensuite on ajoute, sans égoutter , le même volume d’une solution aqueuse d’éosine à 08'r,05 p. 1000. On lave à l’eau courante après deux minutes de contact, on dessèche et on monte dans le baume.

4° Procédé de Hoffmann et Halle (1). — Ces auteurs emploient un procédé spécial dérivé de celui de Weidenreich (2) (coloration du sang) et de Kayser (3) (capsules bactériennes). Il diffère de la méthode de Giemsa par le mode de fixation, qui substitue les vapeurs d’osmium à l’alcool.

On verse dans un verre de montre quelques centimètres cubes d’une solution d’acide osmique à 1 p. 100 additionnée de 10 gouttes d’acide acétique, et on introduit le récipient dans une boîte de Pétri. Des lames, bien propres, sont déposées dans la même boîte, au-dessus du verre de

montre ; on couvre, afin d’empêcher l’évaporation de l’acide osmique et on prolonge le contact pendant deux minutes. Ensuite on étale le matériel à examiner sur la surface de la lame qui a été exposée aux vapeurs osmiques, et on soumet de nouveau la préparation à l’influence de ces vapeurs (deux minutes). On dessèche à l’air, on traite par une solution très étendue (rouge clair) de permanganate de potasse et on colore d’après le procédé lent de Giemsa (Voy. p. 378).

à 37°, on ajoute une solution aqueuse d’éosine dont le titre oscille entre 0sr,10 et 0gr,30 p.100. On filtre et on obtient une poudre soluble dans l’eau et l’alcool méthylique.

(1) Hoffmann et Halle, Münch. med. Woch., 1906, n° 31.

(2) Weidenreich, Folia Hæmatolog., 1906, n° 1.

(3) Kayser, Centralb. für Bakteriolog, vol. 41, fasc. 1.