LA RÉCOLTE ET L'ENSEMENCEMENT DE L'EXPECTORATION

- Il est préférable d'examiner les expectorations après ou pendant une période de crise, car les crachats sont surtout bacillifères à ce moment.

Il est d’autre part préférable de récolter dans un: boîte de Petri stérile, au laboratoire même, les expec- {orations, et ceci, pour deux raisons. D’abord il existe des germes très fragiles qui meurent rapidement, tels que le bacille de Pfeiffer; et, par ailleurs, si l’on demande aux malades d'apporter les expectorations

du matin qui sont particulièrement abondantes, il est

très fréquent de trouver, mélangés aux crachats, du mucus nasal qui, nous le verrons, se caractérise par une flore souvent très différente.

Il est utile, si le malade a des difficultés d’expecloration, de pratiquer une injection d'Evatmine et de Sérum d’Heckel.

Après avoir recueilli les crachats, on en prélève un gros flacon que l’on lave succéssivement dans trois verres stériles de bouillon ou d’eau physiologique.

tée à à re souris re Il faut bratéie pe d' ae

mencer un examen direct des crachats après double

coloration an gram et à la fuchsine de Ziehl au 1/10

pour juger de la quantité et de la qualité des germes.

Pour ensemencer, on se servira du bouillon dans”

lequel une parcelle de crachat à été broyé. Il faut obtenir une division aussi parfaite que possible et remettre en suspension les débris au moment de la semence. | |

On utilise en général trois milieux, la gélose ascite, la gélose vitaminée et la gélose au sang inclinée et en boîtes de Petri. ;

L'ensemencement en gélose au sang en boîtes de Petri est certainement le plus important car il donne en 24 ou 48 heures un aperçu rapide et précis de la flore.

Nous suivons toujours la technique suivante : on laisse fondre au bain-marie trois tubes de gélose. Dès qu'elle est refroidie à 47°, 48° on mélange 5 gouttes de sang humain defibriné par tube. On ajoute deux gouttes de semence dans le premier tube et une goutte dans le deuxième. On vide la pipette et on prélève 5 gouttes de gélose du deuxième tube et on les ajoute au dernier. On incline 3 ou + fois pour bien mélanger et on verse chaque tube dans une boîte de Petri stérile de façon à obtenir une couche de gélose de deux ou trois millimètres d'épaisseur. Si l'opération a été assez rapidement menée le milieu se présente d'un beau rouge homogène.

On place le tout à l’étuve à 37°, en faisant bien attention que la gélose des boîtes de Petri soit tournée

vers le haut,

rable H'attendta: 48 dures gear à ce moment d'aspect ï Sera des plus caractéristiques. | ss Examinons d’ aber u une ae ces boîtes d Petri Nous. verrons : re anne Re

pe Des colonies Pete. Bhdateses entourées par un

che d'hémolyse plus ou moins net ou par. une zone verdâtre ou brunâtre. Ces colonies se développent toujours dans l'épaisseur de la gélose.

2. Des colonies arrondies opaques blanchâtres où jaunâtres parfois à bords déchiquetés se développant toujours à la surface du milieu.

Ces deux aspects correspondent au Streptocoques et aux Pseudomeningocoques, qui sont presque constants dans l’expectoration des asthmatiques. Nous allons insister surtout sur les difficultés des premiers passages de ces germes. Il est important, et on y arrive avec un peu d'habitude, d’avoir des colonies très espacées dans la dernière boîte de Petri car cela facilitera beaucoup les isolements.

En effet l'isolement des Streptocoques sera fait de préférence en milieu liquide : bouillon ascite ou eau peptonée vitaminée et glucosée. Ces premiers passages sont très difficiles si l’on n’emploie pas des milieux riches en albumine ou en glucose. Ensemencés en gélose simple ou en bouillon, ces germes meurent souvent très rapidement. On fers done deux ou trois passages et dès que la souche sera bien adaptée aux milieux on en vérifiera la pureté dans des boîtes de gélose au sang en suivant la technique précédente.

Les pseudomeningocoques se développent théoriquement avec une grande facilité sur tous les milieux.

AD at

En pratique, les premiers passages de ces germes -demandent des précautions. Après avoir identifié les différentes colonies de pseudoméningocoques on prélève avec le fil de platine la colonie entière et on l'étale sur une petite surface dans un tube de gélose au sang inclinée. Deux jours après on repique la souche dans. un nouveau tube de gélose au sang. Après trois passages on fait un isolement et, si nécessaire, une identification plus précise, par des milieux appropriés.

Nous avons insisté sur ces deux espèce de germes. En effet les Streptocoques et les Pseudoméningocoques constituent, dans la plupart des cas, la flore exclusive de l’expectoration des asthmatiques. Les autres germes se présentent parfois avec des caractères atypiques et nous ne citerons pour l'instant que les quelques espèces microbiennes relativement fréquentes.

Le bacille de Pfeiffer se développe surtout en gélose vitaminée. Les colonies petites, transparentes, se reconnaissent facilement.

Le pneumocoque muqueux se caractérise par ses colonies transparentes ayant tendance à descendre «en larme » sur la surface de la gélose.

Enfin le pneumobacille de Friedlander, relativement rare, dont l'aspect est si caractéristique.

Toutes les colonies isolées sont repiquées plusieurs fois sur des milieux appropriés. Après la vérification nécessaire, des souches pures seront obtenues avec lesquelles on pourra préparer les émulsions vaccinales.

Pour cela on procède différemment suivant l’espèce ncrobienne. Les Streptocoques, les Pneumocoques et le Bacille de Pfeiffer ne donnent pas de cultures abondantes en milieu solide. Il faut donc s'adresser

: “aux inilieux liquides et nous utilisons la done. sucrée

< vitaminée dent la composition est la suivante.

Peptone d' estomac de porc 3 500 em'.

rie 2 ee ; * Extrait globulaire de Legroux : 40 cm.

«1: pH ajusté à 7,8. Te RE

Un tube entier d’une culture de 24 heures en eau

peptonée est ensemencé dans un pot à centrifuger de 500 cm’ contenant Ie milieu précédent. Après 24

heures, on centrifuge à 4.000 tours pendant quinze : minutes. On prélève le liquide surnageant et on émul-

sionne le culot dans de l’eau physiologique.

= Pour les autres germes on utilisera les milieux solides. Les Pseudoméningocoques seront ensemencés largement en gélose ascite et les cultures de 24 où 48 heures seront emulsionnées dans de l’eau physiologique. Le pneumobacille de Friedlander se développe très bien en gélose simple.

Nous avons maintenant les émusions qui nous serviront à la préparation du vaccin. Ces émulsions sont chauffées en tubes scellés au bain-marie à une température de 58°. Il est rare que les germes résistent et il faut essayer de stériliser les souches par le minimum de température.

Après chauffage, chaque souche est vérifiée microscopiquement et ensemencée en milieu solide et liquide (1 contrôle de pureté ct de stérilité).

Si les contrôles restent stériles, on peut préparer les émulsions vaccinales. Nous ramenons toujours la quantité des germes à un taux fixé à cinq milliards par cm.

Pour préparer le vaccin polyvalent on doit se baser sur la donnée de l’examen direct et du premier ense-

étent Admettons, par Éniore que î , lage des germes soit, pour un Cas donné, le suivant ie

Streptocoques Hémolytiques }Flore nettement | + Ed Streptocoque Viridans À prédominante RE À Flavus nombreuses colonies Ro

ie

ie ê : En ir compte que nous avons ‘ramené toutes “es | nos souches à un taux de cinq milliards par € em" nous LE mélangerons : : TES

- 35 cm° de l’émulsion de Streptocoques Hemolytiques , 35 em‘ de l’émulsion de Streptocoques Viridans. + = 30 em’ de l’émulsion de Flavus. |

et par conséquent chaque cm’ de vaccin contiendra :

Streptocoques H et V 3 milliards 5.

Flavus 1 milliard 5.

Le vaccin préparé, on procède à un deuxième contrôle avant la mise en ampoule (gélose et bouillon; deuxième contrôle de pureté et de stérilité).

Après 48 heures, on met en ampoules. On prélève deux de ces ampoules qui sont ensemencées en gélose

sors

ascite el en eau peptonée sucrée (troisième contrôle de stérilité). Si les contrôles restent stériles on peut livrer le vaccin deux jours après.

Dans toute la préparation des vaccins nous n’avons pas employé une seule goutte d’antiseptique car nos contrôles nous permettent d’être parfaitement sûrs de la pureté et de Ia stérilité de nos émulsions. Nous pensons en effet que l’adjonction d’antiseptiques aux vaccins est inutile et dangereuse. |

Elle est inutile, car un vaccin doit être pur et stérile. En cas contraire, il ne doit pas être utilisé.

Elle est dangereuse car un antiseptique ne fait que masquer certaines impuretés des émulsions vaccinales

et empêcher qu’elles puissent être décélées par les contrôles. Mais des germes peuvent rester vivants et être la cause d'accidents quand iis sont inoculés à des malades. : :

Donc, en définitive, à notre avis, le chauffage minimum constitue pour l'instant le moyen le plus efficace et le moins nuisible au pouvoir antigène qui est dévolu aux vaccins.

I 'est préférable de préparer d'emblée un nombre assez important d’ampoules car le traitement de l'asthme par les vaccins doit être très prolongé si l’on veut obtenir des résultats thérapeutiques favorables.