TECHNIQUE DE L'ISOLEMENT DU BACTÉRIOPHAGE

Tout laboratoire de bactériologie possède le matériel nécessaire pour Tisolement et la culture du Bactériophage. Un appareil à filtration sur bougie est indispensable : j'ai toujours employé le modèle de Martin, avec bougies Chamberland L2 ou L3. Comme milieux de culture : du bouillon peptoné et du bouillon gélose à 2 0/0.

On peut avoir à rechercher la présence d'un Bactériophage actif dans des matières qui requièrent un traitement préalable, par suite de leur état physique qui ne se prête pas à la filtration sur bougie.

i^ Il s'agit d'un liquide stérile, au sens actuel du mot (i), par

. (i) Dans le cours de cet ouvrage je me trouverai fréquemment g-êné dans l'exposition des faits, faute d'expressions appropriées à certains états. Je dénommerai « stérile y> un milieu ne renfermant aucun microbe visible au microscope, ou cultivable dans un milieu artificiel, et « ultrastérile » un milieu ne contenant pas d'ultramicrobes. Un produit renfermant le virus de la rougeole, par exemple, est stérile mais non pas ultrastérile, puisque, s'il «st vrai qu'il ne contient rien de visible ou de cultivable, il peut toutefois

12 LE BACTémOPHAGE

exemple du^sang, ou d'un liquide organique prélevé aseptîquement. Aucun traitement n'est nécessaire.

2® La matière sur laquelle s'effectue la recherche est un liquide limpide non stérile : on le filtre sur bougie pour le débarrasser des bactéries ; le Bactériophage passe dans le filtrat.

3° C'est un milieu présentant un trouble homogène : une culture bactérienne, par exemple. La filtration directe provoquerait la colmatation rapide de la bougie, il faut donc au préalable dégrossir le liquide : voici le procédé le plus efficace.

Prendre un entonnoir garni d'un filtre plissé assez grand pour recevoir en une fois tout le liquide à filtrer; verser dans un verre de l'eau ordinaire, y ajouter une pincée de terre d'infusoires, bien agiter et verser d'un seul coup sur le filtre. Une fois Peau écoulée on obtient un fin revêtement de terre d'infusoires qui tapisse la surface du filtre. Filtrer alors le liquide en essai, qui est ensuite passé à la bougie.

4^ Il s*agit, ou d'un liquide tenant en suspension des particules organiques, ou d'une matière plus ou moins solide ; ce sera le cas le plus fréquent : déjections plus ou moins liquides, pâteuses ou solides ; fumier plus ou moins mélangé de terre ; débris d'organes, etc.. Il y a lieu de désagréger aussi parfaitement que possible le matériel à examiner.

Le procédé le plus simple consiste à émulsionner soigneusement la matière dans du bouillon, à raison de 2 à 5 g. pour 5o cm^ ; placer cette émulsion à Tétuve à 870 pendant 12 à 18 h. : les fermentations, qui s'effectuent sous l'influence de la culture des diverses bactéries qui souillent le milieu, produisent une dcsagré^alion suffisante. Au sortir de l'étuve il ne reste plus qu'à opérer comme dans le cas précédent : filtration sur terre d'infusoires puis sur bougie.

Si la matière en expérience renfermait un Bactériophage, ce Bactériophage se trouve dans le filtrat.

Deux cas peuvent alors se présenter :

A. Recherche d'un Bactériophage actif contre une bactérie donnée.

transmettre la rougeole. Un milieu qui contient des ultramicrobes baclériophages est également stérile au sens bactériologique actuel du mot, puisqu'il ■est limpide et que le germe qu'il renferme ne se cultive dans aucun milieu artificiel, mais il n'est pas ultrastérile car il contient un principe qui se cultive aux dépens des bactéries, comme le virus rougeoleux se cultive aux dépens d'organismes supérieurs.

ISOLEMENT DU BAGTÉRIOPHAGE i3

B. Recherche de Tactivité du Batériophage, soit contre diverses bactéries, soit contre une ou des bactéries indéterminées.

A. Le premier cas est le plus simple, examinons-le tout d'abord et prenons comme exemple la recherche d'un Bactériophage actif contre le Bacille dysentérique de Shiga.

Nous avons ensemencé la veille avec ce bacille un tube de gélose inclinée ; en partant de cette culture jeune nous ensemençons trois tubes de bouillon peptoné (i).

On ajoute dans le premier tube une goutte du filtrat, dix dans le second, 2 cm^ dans le troisième. Un tube simplement ensemencé avec le bacille dysentérique sert de témoin. Ces tubes sont placés à Tétuve à 87°. Après 12-18 h., trois cas peuvent se présenter : les trois tubes se sont troublés par suite d'une culture du bacille dysentérique, un ou deux seulement des trois tubes se sont troublés, les trois tubes sont restés limpides.

i^ Les trois tubes sont troubles : il faut bien se garder d'en conclure qu'il y a absence du Bactériophage actif, car, en ne prenant comme critérium de sa présence que la lyse des bactéries, il passerait la plupart du temps inaperçu. La lyse ne représente qu'un fait spécial au milieu d'un ensemble de phénomènes fort complexes.

Les trois tubes étant troubles, prélever environ i/5o de cm^ de chacune des trois cultures, au moyen d'une boucle de platine, et l'étaler à la surface de trois tubes de gélose inclinée. Après incubation, si ces tubes présentent une culture normale de bacilles dysentériques, la recherche est négative : le matériel primitif ne contenait pas de Bactériophage actif contre le bacille dysentérique de Shiga.

La présence d'un Bactériophage actif est indiquée par l'aspect anormal de la nappe bacillaire qui s'est développée sur la gélose : suivant le nombre des ultramicrobes bactériophages^ cet aspect varie. La couche de bacilles peut présenter une ou plusieurs plages circulaires, où la surface de la gélose est nue, sans trace de culture apparente ; la couche bacillaire peut présenter un aspect déchiqueté, corrodé, par suite de la confluence des plages ; il peut même ne rester que quelques lambeaux de culture ou des colonies isolées ;

(i) Comme on le verra plus loin ce bouillon doit être alcalin : du bouillon ordinaire des laboratoires (j'ai toujours employé de préférence le bouillon Martin) neutralisé puis additionné de 6 cm' de solution normale de soude par litre, convient parfaitement; c'est d'ailleurs le degré d'alcalinité le plus fréquemment employé en bactériologie.

l4 LE BAGTJSRIOPIIAGE

enfin si le nombre des ultramicrobes est encore plus considérable, la gélose peut rester vierge de toute culture apparente.

Comme nous le verrons, chaque souche du Bactériophage possède une virulence propre, le mot virulence étant pris dans son sens réel, c'est-à-dire « d'aptitude à se développer aux dépens de l'être parasité ». Certaines souches du Bactériophage se multiplient très rapidement, d'autres ne végètent que lentement : les premières jouissent d^une grande virulence vis-à-vis de la bactérie qu'on lui a fournie pour se développer, les secondes ne possèdent qu'une virulence faible. Nous aurons d'ailleurs à revenir sur cette notion de la virulence du Bactériophage qui sera traitée en détail dans un chapitre spécial. Je ne fais ici que la signaler rapidement pour donner la raison de la diversité d'action des différentes souches du Bactériophage que l'on constate lors de ^isolement. Le diamètre des plages, essentiellement variable suivant les souches du Bactériophage, depuis une fraction de millimètre (la couche bactérienne paraît comme parsemée de piqûres d'aiguilles), jusqu'à 4 à 5 mm., donne une mesure de la virulence : plus les plages sont étendues, plus le Bactériophage est virulent. Nous verrons que. quelle que soit la virulence d'une souche du Bactériophage au sortir de l'organisme, il est possible de l'exalter in vitro,

2® Le ou les deux premiers tubes seuls ont donné une culture de bacilles dysentériques : le filtrat contenait un Bactériophage d'une activité moyenne ou forte. On n'a qu'à opérer comme dans le cas suivant pour obtenir les plages sur gélose.

3® Les trois tubes sont restés limpides : on se trouve en présence d'un Bactériophage extrêmement actif. La vérification est simple : prendre trois tubes de bouillon, y ajouter une émulsion de bacilles jeunes, provenant' d'une culture sur gélose, de manière à obtenir un léger louche ; introduire dans chacun de ces tubes une goutte du liquide prélevée respectivement dans chacun des trois tubes restés limpides, agiter, puis répartir immédiatement une boucle de chacune de ces trois émulsions à la surface d'autant de tubes de gélose inclinée. Placera Tétuve. Après i2-ï8 h., les trois tubes d'émulsion seront à leur tour limpides et sur les trois tubes de gélose on aura les cultures caractéristiques décrites précédemment.

J'ai pris le Bacille dysentérique de Shiga comme exemple : quelle que soit la bactérie vis-à-vis de laquelle on veuille rechercher un Bactériophage actif, la technique de l'isolement reste semblable, il suffit d'ensemencer le milieu avec la bactérie en cause; si l'on

ISOLEMENT DU BACTSRIOPHAGE l5

recherche par exemple un Bactériophage actif pour le Bacille pesleux, il faudra ensemencer les tubes de bouillon avec le Bacille pesteux.

B. Au lieu de rechercher si une matière renferme un Bactériophage actif pour une bactérie donnée, on peut se proposer de vérifier s'il s'y trouve un Bactériophage doué d'activité vis-à-vis de plu- • sieurs bactéries à la fois. Il suffira de préparer autant de séries de trois tubes qu'il y aura de bactéries vis-à-vis desquelles se fera la ' recherche.

Soit à rechercher l'activité du Bactériophage intestinal vis-à-vis des Bacilles dysentériques de Shiga, de Flexner et de Hiss, du B. typhique et du B, eoli. On préparera cinq séries de trois tubes : la première série sera ensemencée avec le Bacille de Shiga, la seconde avec le Bacille de Flexner, la troisième avec le Bacille de Hiss, la quatrième avec le Bacille typhique, la cinquième avec le B. coli. Dans le premier tube de chacune des cinq séries on ajoutera une goutte du filtrat, dans le second dix gouttes, dans le troisième 2 cm^ et l'on opérera avec chaque série comme je Tai indiqué en détail pour la série Shiga.

Pour les recherches courantes on pourra n'employer qu'un seul tube au lieu de trois, on y ajoutera dix gouttes de filtrat. Le seul risque de ce procédé simplifié, c'est de laisser passer inaperçu un Bactériophage doué d'activité très faible (i).

(1) Je dois faire ici une remarque au sujet d'un procédé indiqué par BoRDET et CiucA et sur lequel ces auteurs ont d'ailleurs basé leur théorie de la lyse héréditaire. Ils inoculent, à trois ou quatre reprises différentes, à quelques jours d'intervalle, une culture de Bacille coli dans la cavité péritonéale d'un cobaye ; le lendemain de la dernière injection il suffirait, d'après eux, de laver la cavité péritonéale : le principe faisant naître « l'hérédité à la lyse » se trouverait dans le liquide. Il ressort de leur première communication qu'ils considéraient qu'il s'agissait là d'un* fait d'ordre général, ce qui d'ailleurs était une des conditions sine qua non de l'exactitude de leur théorie : à une injection d'une bactérie quelconque, l'organisme devait répondre par ]a production d'un principe qui donnait naissance au phénomène de la lyse en série ; ils annonçaient qu'ils feraient prochainement connaître les résultats obtenus avec diverses bactéries. La communication annoncée n'a jamais

. paru. J'ai essayé vainement de reproduire l'expérience décrite par Bordet et CiuGA cl je sais que de nombreux chercheurs ont éprouvé le même mécompte. £n réalité, dans cette expérience, il y a eu passage du Bactériophage anticoli, qui se trouvait naturellement dans l'intestin du cobaye mis en expérience, dans la cavité péritonéale à la faveur de l'irritation produite par

' rinoculation ; puis culture dans la cavité même aux dépens des bacilles coli

l6 LE BACTÉRIOPHAOE