EXALTATION DE LA VIRULENCE

On peut encore pratiquer les passages successifs sur gélose inclinée. On prend le tube présentant des plages, avec un fil de platine on prélève la culture bactérienne en bordure d'une plage et on l'ensemence à la surface d'un tube de gélose stérile ; on fait un second ensemencement semblable au premier, en partant d'une plage située sur la culture de ce second tube, puis un troisième, un 'quatrième, et ainsi de suite. Quand on n'a plus que des fragments de culture épars sur la gélose, on lave soigneusement la surface du dernier tube avec du bouillon que l'on filtre ensuite sur terre d'infusoires, puis sur bougie. Dans le filtrat on a souvent un Bactériophage déjà suffisamment actif pour provoquer la lyse d'une émulsion en bouillon.

Comme nous le verrons, le Bactériophage n'est .détruit qu'à 65** C, c'est-à-dire à une température supérieure à la température mortelle pour la plupart des bactéries non sporulées. On peut donc remplacer la filtration par un chauffage d'une demi-heure à 58-6o° qui tue les bactéries et respecte le Bactériophage. Je préfère la filtration qui m'a toujours paru donner de meilleurs résultats.

J'indiquerai dans le chapitre suivant, au paragraphe intitulé « Cultures multiples », un troisième procédé.

On peut enfin, dans certains cas, exalter la virulence du Bactériophage in vivo. On fait ingérer à un cobaye 2 cm^ du filtrat contenant le Bactériophage à exalter ; d'autre part on introduit dans le péritoine de l'animal quelques centimètres cubes de la culture de la bactérie vis-à-vis de laquelle le Bactériophage est actif. Après 1 2-18 h. on injecte de nouveau dans le péritoine 10 cm^ de bouillon stérile ; puis, quelques minutes après, on prélève avec un trocart l'exsudat péritonéal que l'on recueille dans un tube renfermant quelques centimètres cubes d'eau citratée. Après quelques heures d'étuve, on filtre sur terre d'infusoires puis sur bougie : on obtient souvent dans le filtrat un Bactériophage sensiblement plus virulent que celui <jui a été ingéré par le cobaye.

NUMÉRATION DES ULTRAMICROBES BACTÉRIOPHAGES

Une trace d'un filtrat renfermant un Bactériophage très actij contre une bactérie donnée, introduite dans une émulsion en bouillon de cette bactérie, provoque en l'espace de quelques heures la

l8 LE BACTÉRIOPHAGE

lyse des bactéries : le milieu devient aussi limpide que du bouillon non ensemencé. Une trace de Témulsion lysée, introduite dans une nouvelle émulsion semblable à la première, provoque également la lyse des bactéries; une trace de cette seconde émulsion devenue limpide, introduite dans une troisième, reproduit le même phénomène et ainsi de suite. J^ai, pendant plus de trois ans, effectué avec une même souche des passages journaliers, parfois même deux et jusqu'à trois passages dans la même journée, introduisant à chaque passage environ un millième de centimètre cube du dernier tube lysé dans le tube d'émulsion suivante, et après plus de i.5oo passages Témulsion lysée du dernier tube était aussi active, et même plus active, que le filtrat ayant servi à déclancher le phénomène dans le premier tube de la série.

Une émulsion une fois lysée ne renferme plus aucune bactérie vivante, par contre la quantité d'ultramicrobes bactériophages introduite pour amorcer la lyse s'est augmentée, puisque le nouveau lysat est aussi actif que le précédent; J'émulsion lysée est devenue ce que Ton peut appeler, au sens strict du mot, une culture du Bactériophage.

Nous avons vu précédemment que Tensemencement sur gélose d'une émulsion bactérienne à laquelle on venait d'ajouter une petite quantité d'un liquide contenant le principe actif, donnait une culture bactérienne parsemée de plages : cette observation va nous permettre de suivre déplus près le phénomène de la multiplication des ultramicrobes, puisque chaque plage représente indubitablement l'endroit où, pendant l'étalement, s'est déposé un élément actif, soit un ultramicrobe. Il nous suffit d'opérer sur des quantités mesurées pour savoir le nombre de germes actifs existant dans un liquide.

Je prends au hasard, dans un cachier d'expériences, une numération* à titre d'exemple.

Pour éviter les répétitions inutiles, je préciserai d'abord ce qu'il faudra entendre par « émulsion de bacilles de Shiga », sans autre indication.

On prépare, une fois pour toutes, par -les procédés connus, une série de tubes étalons contenant des émulsions titrées à roo, 200, 25o, 3oo et 4oo millions de bacilles de Shiga par cm^ ; ces émulsions sont stabilisées par l'addition d'une petite quantité de formol ; les tubes qui les renferment sont ensuite scellés au chalumeau.

L'émulsion destinée à la lyse doit être préparée de préférence avec des bacilles provenant d'une culture jeune sur gélose inclinée.

NUMERATION DES ULTRAMIGROBES

On prépare d'abord une émulsion concentrée, en introduisant dans le tube I ou 2 cm^ de bouillon, on incline pendant quelques minutes de manière à ce que la couche bacillaire soit complètement recouverte de liquide, puis on agite : l'émulsion est parfaite. On prélève avec une pipette une certaine quantité de cette émulsion concentrée et on la verse, goutte à goutte, dans un tube de bouillon jusqu'à ce que l'opacité soit plus forte que celle du tube étalon à deux cents millions et plus faible que celle du. tube à trois cents. L'approximation est suffisante dans la pratique courante : on a une émulsion qui renferme environ deux cent cinquante millions de bacilles par centimètre cube de milieu. C'est cette émulsion que je prendrai pour type. On peut également employer une culture jeune en bouillon : je préfère l'émulsion qui se prête mieux h une concentration déterminée.

Exp. I. — Un tube contenant lo cm^ d'émulsion de bacilles de Shiga est additionnée de i/5o ooo de cm^ d'une culture de Bactériophag-e âgée de 10 joursi c'est-à-dire d'une émulsion de Shiga lysèe depuis lo jours. Le tube est agité pour répartir uniformément la semence ; je prélève de suite, au moyen d^une fine boucle de platine tarée, i/ioo de cm^ de Témulsion que je répartis le plus uniformément possible, par frottements, à la surface de la gélose d'un tube incliné. Ce tube est placé à Tétuve à 870. Après 18 h. il présente une culture de Shiga parsemée de 5i plages.

Le calcul est simple : les 10 cm^ d'émulsion ont reçu i ^5o.ooo de cm^ de culture de Bactériophage, soit i/5oo.ooo de cm' pour chaque centimètre cube d'émulsion. J'ai prélevé i/ioode cm' qui contenait donc ï/5o.ooo.ooode cm' de la culture de Bactériophage ; ce i/ioo de cm' étalé sur la gélose a donné 5i plages, soit 5i colonies provenant chacune d'un germe bactériophage déposé pendant l'étalement. 5i germes pour i/5o.ooo.ooo de cm' représentent 2. 55o. 000. 000 de germes par centimètre cube : c'est ce que contenait donc la culture du Bactériophage qui a servi à ensemencer l'émulsion.

La technique de la numération des ultramicrobes bactériophages ne diffère guère, comme on peut s'en rendre compte, de celle des bactéries ordinaires ; pour ces dernières on obtient des colonies isolées sur une surface par ailleurs stérile, pour les ultramicrobes on obtient des plages représentant des colonies parsemant une couche bactérienne. II ne peut en être autrement puisque l'ultramicrobe bactériophage ne peut se développer qu'aux dépens des bactéries qui constituent son milieu de culture.

Chaque plage représente bien une colonie de Bactériophages, car, si Ton en touche le centre avec la pointe effilée d'une pipette, et si Ton trempe cette pointe dans une émulsion de bacilles dysentériques, cette émulsion, étalée sur gélose, reproduit les plages caractéristiques ; de plus elle-même se lyse en l'espace de quelques heures. La plage, en apparence stérile, était donc bien en réalité une colonie d'ultramicrobes bactériophages.

MULTIPLICATION DES ULTRAMICROBES BACTÉRIOPHAGES

La méthode de numération va nous permettre de suivre de plus près la multiplication des germes bactériophages au cours de l'action.

Pour une même émulsion de bacilles de Shiga, toujours à 260 millions par centimètre cube, deux cas extrêmes sont surtout intéressants à considérer : l'inoculation (r) avec de nombreux germes bactériophages, rinoculalion avec un minimum de germes : un ou deux seulement.

i^ Inoculation massive. — 10 cm* d'émulsionde bacilles de Shiga sont inoculés avec 1/26 de cm* d'une culture du Bactériophage contenant trois milliards de germes par centimètre cube. On place le tube d'émulsion à Tétuve. Observé macroscopiquement de temps à autre, on voit que le trouble se maintient à peu près constantjusqu'à la troisième heure (2), à partir de ce moment le liquide s'éclair-

(i) Comme je Tai déjà fait remarquer, l'élude du Baclériopha/Bce présente une extrême complexité du fait que nous avons toujours à considérer les actions et réactions mutuelles de trois facteurs variables : milieu, bactérie, Bactériophage, et cette complexité rend parfois difficile Texposé d^s faits par crainte d'équivoque, faute de mots appropriés. Ici, par exemple, comment appeler Tacle d'introduire une certaine quantité d'une culture du Bactériophage dans une culture bactérienne ? Je pourrais évidemment employer le terme « ensemencement » mais le milieu a déjà été ensemencé avec la bactérie, et dans certains cas il pourrait j avoir équivoque. Le terme propre serait a contamination », malheureusement ce terme a' pris en bactériologie un sens précis, synonyme de souillure. Je choisis donc le terme « inoculation ». J'ensemencerai donc un milieu avec une bactérie, puis j'inoculerai la culture avec le Bactériophage.

(2) On observe assez souvent, sans que j'aie d'ailleurs encore pu fixer exactement les conditions d'apparition du phénomène, que la dissolution des bâclé-

MULTIPLICATION DES ULTRAMICROBES 21

oit peu à peu : entre la quatrième et la sixième heure à partir du moment de Finoculation, il est devenu limpide.

Je prélève, immédiatement après Tinoculation, et ensuite à intervalles réguliers au cours des 6 h., une boucle du liquide que j'étale sur gélose : tous les tubes restent stériles. On serait tenté de croire que Tabsence de toute colonie de Shiga tient au fait que tous les bacilles ont été tués dès le premier contact avec la culture du Bactériophage inoculée : il n'en est rien, car, si au lieu d'ensemencer sur gélose Vémulsion telle quelle, on la dilue au préalable au millième dans du bouillon, cette dilution étalée sur gélose donne naissance à de nombreuses colonies de bacilles de Shiga. Les bacilles n'étaient donc nullement tués ; si l'étalement direct sur gélose de l'émulsion est resté stérile, c'est qu'on a ensemencé en même temps et des bacilles de Shiga vivants et des germes bactériophages en très grand nombre. Les bacilles ont bien commencé à se multiplier sur le milieu nutritif, mais les ultramicrobes bactériophages ne sont pas restés înactifs, trouvant des bacilles à leur portée ils les ont parasité, se sont reproduits et ont empêché toute culture bacillaire. Au contraire, pendant l'étalement de l'émulsion diluée au millième, les bacilles et les germes bactériophages, mille fois moins nombreux, se sont trouvés séparés par des espaces suffisamment grands pour qu'une interaction ne fut plus possible, ce qui a permis aux bacilles qui ne se trouvaient pas au voisinage immédiat d'un ultramicrobe de se multiplier et de former des colonies.

Une seconde dilution au millième de l'émulsion, après que celleci est restée pendant i h. à l'étuve, étalée sur gélose, reste le plus souvent stérile ou ne donne naissance qu'à de très rares colonies ; après 2 h. la gélose reste toujours stérile : tous les bacilles contenus dans l'émulsion étaient donc à ce moment attaqués, et aucun n'a pu se reproduire.

2^ Ensemencement a l'unité. — Six tubes d'émulsion de bacilles de Shiga sont inoculés avec une dilution telle d'une culture du Bactériophage (renfermant trois milliards d'ultramicrobes par centimètre cube), que chaque tube en reçoit un six milliardième de

ries est précédée d'une ag'glutination très nette. On observe surtout ce phénomène quand on inocule l'émulsion bactérienne avec une quantité relativement élevée (une dizaine de gouttes, par exemple) d'une culture d'un Bactériophage de virulence moyenne.

12 LE BACTfiRIOPBAaK

centimètre cube. Placés à Tétuve, quatre donnèrent une culture normale de bacilles dysentériques, tous les étalements sur gélose fournirent des cultures normales : ces quatre tubes n'avaient donc reçu aucun ultramicrobe bactériopbage, nous ne nous en occuperons pas.

Les deux autres tubes, qui avaient reçu chacun probablement un, certainement pas plus de deux ultramicrobes, présentèrent Taspect ' suivant. L'émulsion devint de plus en plus trouble : après 2 h. à Tétuv/î l'opacité de l'émulsion était environ deux fois plus forte qu'au début ; après 3 h., deux fois et demi; après l\ h. trois fois; elle commence alors à s'éclaircir, après 5 h. elle est deux fois ce qu'elle était au début, l'éclaircissement se poursuivant ensuite peu à peu pour devenir à peu près total après i4 h.

Immédiatement après l'inoculation du Bactériophage, puis de demi-heure en demi-heure, i/5o de cm' fut prélevé de chacune de ces deux émulsions et étalé sur gélose inclinée ; après incubation, le résultat fut le suivant :

étalements effectués après 1/2, i, i 1/2 et 2 h., couche normale de bacilles de Shiga sur la gélose ;

après 2 h. 1/2 : 3 plages sur un tube, 5 sur Tautre, moyenne 4- Après 2 h. 1/2 l'émulsion inoculée avec un ultramicrobe bactériophage en contient donc alors 2.000 ;

après 3 h. : 5 plages et 4 plages. Aucun accroissement entre 2 h. 1/2 et 3 h.;

après 3 h. 1/2 : 9 et 5 plages, moyenne 7; le nombre d'ultramicrobes n'a guère augmenté ;

après 4 h. : loi et m plages; moyenne io5. L'émulsion contient donc après 4 h. de 5o.ooo à 60.000 ultramicrobes bactériophages ;

après 4 b« 1/2 : i45 et 160 plages, moyenne 162; soit pour l'émulsion 75.000, chiffre peu différent du précédent;

après 5 h., les géloses sont stériles. Une dilution au millième dans une émulsion de Shiga, étalée de la même manière sur gélose, donne 4 et 6 plages. L'émulsion après 5 h. contient par conséquent plus de i.5oo.ooo ultramicrobes bactériophages.

La multiplication des ultramicrobes bactériophages est donc extrêmement rapide et, ce qui est remarquable, se produit par à-coups successifs, chaque accroissement étaat séparé par un intervalle de temps d'environ 76 minutes. Nous aurons d'ailleurs à revenir sur cette expérience quand nous étudierons le mode de reproduction du Bactériophage.

XULTIPUC^TIC» DKS CXTRAJaCROlIGS sS

L'expérience montre de pins qnll snffit de la présence d*un seul ultramicrobe dans one émolâon bactérienne, pourvu qu'il pni>vienne d'une souche au maximum d'activité, pour que la Ivse des bactéries soit totale.

Inutile de dire que ces expériences ont été renouvelées un sT«atnd nombre de fois, toujours avec un semblable résultat: il en a été d'ailleurs de même pour chacune des expériences relatées dans cet ouvragée. Je désire attirer lattention des expérimentateurs sur un point important : du moment qu'il s'agit d'une souche du Bactériophage suffisamment rirulente, le résultat final de Texpérience est le même, sans aucune exception : accroissement du nombre des tilt ramicrobes inoculés et Ivse totale de Témulsion bactérienne. En répétant plusieurs fois la même expérience avec la même souche de Bactériophage, en se plaçant naturellement toujours dans les mêmes conditions de milieu et de température, la multiplication des ultramicrobes se produit sensiblement de la même manière et la lyse s'effectue dans le même temps : mais si Ton étudie comparativement des souches différentes, quoique toutes douées d'une grande activité, on observe alors des différences notables : avec telle souche on obtiendra la lyse totale après 3 h. 12 (c'est le minimum que j aie observé), avec telle autre seulement après i4b., toutes les conditions étant égales. En un mot, et cette observation s'applique à toutes les expériences exposées au cours de cet ouvrage, le phénomène se produira toujours comme je l'indique, les temps seuls pourront varier : rullramicrobe bactériophage est un être vivant et comme tel, les actions qu'il produit ne peuvent avoir la régularité d'une action diastasique.

Exp. — Voici, à litre d'exemple, une expérience réalisée avec une autre souche du Bactériophagce : on va voir que la lyse s'est produite en un temps beaucoup plus court que dans les expériences ci-dessus.

Ëmulsion de Shiga dans du bouillon préalablement chauffé à 38o. Inoculation avec i/io.ooo de cni^ de culture du Bactériophage;

après 2 h. émulsion 3 fois plus trouble qu'au début;

après 2 b. 1/2, trouble environ 3 1/2 fois plus fort qu'au début;

après 2 h. 45, trouble environ 3 fois plus fort qu'au début;

après 3 h. louche extrêmement léger.

Dans cette expérience la lyse s'est donc presque totalement effectuée en l'espace de quinze minutes, entre a h. 45 et 3 h. après l'inoculation.

Un seul ultramicrobe bactériophage est donc suffisant pour pro-

2^ LE BAGTERIOPHAGE

voquer la lyse ; si nous effectuons des dilutions successives, en ensemençant, par exemple, une goutte d'une culture du Bactériophage dans un tube de bouillon stérile, une goutte de ce premier tube dans un second, une goutte du second dans un troisième, et ainsi de suite ; si ensuite nous introduisons dans chacun de ces tubes une certaine quantité d'une émulsion concentrée de bacilles de Shiga, on obtiendra la lyse dans tous les tubes qui auront reçu au moins un ultramicrobe, soit ordinairement les quatre premiers de ia série, dans les tubes suivants on aura une culture normale de Shiga. Comme nous avons fait de^ comptages sur gélose, le fait s'explique de luî-même, mais si Ton se prive de ce moyen d'investigation, on s'expose à commettre une grave erreur et à conclure qu'il y a eu culture des ultramicrobes bactériophages dans du bouillon stérile dans les quatre premiers tubes de la série. Cette erreur a d'ailleurs été commise par certains auteurs. En réalité il y a eu simplement dilution, la dilution restant active tant qu'il s'y trouve un ultramicrobe.

Connaissant le nombre d'ultramicrobes dans une émulsion lysée, qui est par le fait même devenue une culture du Bactériophage, et le taux de la dilution, on peut mathématiquement indiquer si la lyse de l'émulsion bactérienne inoculée avec une telle dilution, se produira ou n'aura pas lieu. J'ai effectué cette expérience plus de cent fois avec les souches de Bactériophages les plus diverses.