COLONIES ISOLÉES

Nous avons vu que le Bactériophage donnait des colonies apparentes sur gélose; que, pour les obtenir, il suffisait d'inoculer très faiblement une émulsion de bacilles de Shiga en bouillon avec une culture du Bactériophage et d'étaler de suite sur gélose une goutte de cette émulsion. Après incubation on obtient une couche bacillaire présentant un certain nombre de plages dépourvues de toute culture apparente. Si l'inoculation du Bactériophage a été massive, la surface de la gélose paraît stérile. Examinons les caractères de ces cultures.

La surface de la gélose restée nue par suite de la présence d'un grand nombre de germes bactériophages, garde indéfiniment cette

CULTURE SUA MILIEUX SOLIDES 3l

apparente stérilité : elle est devenue impropre à la culture du bacille de Shiga ; ensemencée à un moment quelconque avec une culture de ces bacilles, même d'une manière très abondante, on n'observe pas le plus léger développement. Le milieu est pourtant normal pour une autre bactérie : ensemençons-le, par exemple, avec du vibrion cholérique, la culture de ces bactéries s'y fera aussi bien que sur un milieu neuf. Si la culture du Shiga ne se fait pas, c'est que les germes bactériophages restent sur la surface de la gélose et exercent leur action dissolvante sur les bacilles qu'on y dépose. Le fait est facilement vérifiable; prenons un tube de gélose resté en apparence stérile après avoir été recouverte avec une émuisîon bactérienne inoculée avec une culture de bactériophage, lavons la surface de la gélose avec quelques gouttes de bouillon que nous introduisons ensuite dans une émulsion fraîche : cette émulsion sera lysée en respace de quelques heures.

Il arrive parfois, surtout quand on fait usage d'une gélose un peu sèche, qu'on obtient quelques colonies de Shiga, toujours situées à Textrême bord de la couche de gélose ; nous aurons à revenir sur cette particularité extrêmement intéressante dans la partie de ce travail relative aux cultures secondaires.

Au lieu d'une couche continue de germes bactériophages, déposons ces germes en des endroits limités, ce qui est facilement réalisé en déposant des gouttes de culture du Bactériophage en différents points sur la surface stérile d'un tube de gélose, ou encore en dessinant des traînées avec une boucle de platine trempée dans la culture du Bactériophage; après avoir laissé ces tubes inclinés à l'étuve pendant quelques heures pour obtenir le dessèchement de la culture déposée et éviter le ruissellement, si nous arrosons la surface de la gélose avec une émulsion de bacilles de Shiga, nous verrons que les endroits imprégnés avec la culture du Bactériophage restent vierges de bacilles de Shiga qui, au contraire, se cultivent parfaitement sur les parties non touchées.

Quand, dans Témulsion étalée sur gélose, le nombre de bacilles est infiniment grand et celui des ultramicrobes assez petit pour qu'il n'y en ait que quelques unités éparses à la surface de la gélose, on obtient une couche bacillaire parsemée de plages paraissant stériles. Ces plages ont une forme circulaire, le diamètre varie de i à 5 mm. Les plages sont en général d'autant plus étendues que l'émulsion bacillaire était plus faible, quoique suffisamment concentrée pour donner, non pas des colonies isolées mais une couche continue. Sur

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un même tube les plages sont d'autant plus étendues que la couche sous-jacente de gélose est plus épaisse, soit vers le fond du tube. Si l'on garde le tube présentant de telles plages à Tétuve à 87** pendant un certain nombre de jours, on s'aperçoit que les plages n'augmentent pas d'étendue ; leur diamètre reste indéfiniment à peu près ce qu'il était au début. Aussitôt la culture bien développée, soit après 18-24 h. d'étuve, touchons avec un fin fil de platine le centre d'une plage et trempons-le ensuite dans une émulsion de Shiga : le Bactériophage se développe dans cette émulsion qui se lyse après quelques heures. La plage stérile n'était donc pas ultrastérile, c'était donc bien en réalité une colonie de Bactériophage.

Prélevons ensuite, toujours avec un fin fil de platine, une trace de la couche bacillaire à la périphérie d'une plage ; l'ensemencement sur gélose reste stérile et l'inoculation dans une émulsion montre que les germes bactériophages y sont présents.

Touchons maintenant, de la même manière, la couche bacillaire, non plus à la périphérie immédiate d'une plage, mais à une distance rapprochée, à 2 mm. par exemple; les ensemencements montrent qu'à cet endroit les bacilles sont normaux, aucun ullramicrobe ne s'y trouve.

Replaçons à l'étuve la culture présentant les plages et, trois ou quatre jours plus tard, répétons le dernier essai : touchons la couche bacillaire à 2 mm. d'une plage et ensemençons sur gélose et en émulsion : le Bactériophage y est maintenant présent. Les ultramicrobes bactériophages ont donc envahi peu à peu la couche bacillaire, toutefois cet envahissement est lent, de plus en plus lent avec le temps; l'anneau envahi, même après plusieurs mois, n'est pas supérieur à quelques millimètres. En dehors de cette zone le Shiga reste repiquable aussi longtemps qu'un tube témoin sans Bactériophage.

Pourquoi le Bactériophage n'envahit-il pas toute la couche bactérienne? Il y a à cela deux raisons.

Les germes bactériophages attaquent d'autant plus facilement une bactérie que cette bactérie est plus jeune. Les ultramicrobes déposés sur la gélose se trouvent dès l'ensemencement au voisinage de bacilles qui se reproduisent activement aussitôt leur dépôt sur le milieu nutritif; ils trouvent donc à leur portée des bacilles très jeunes disposés en couche très mince sur la gélose : la lyse peut être complète, d'où l'apparente stérilité de la plage. Mais en dehors de la zone envahie par les ultramicrobes dès les premières heures, les

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bacilles se développent librement, forment une couche de plus en plus épaisse de bacilles de plus en plus âgés, ce qui revient à dire de plus en plus résistant à la lyse. Le fait est facilement vérifiable par expérience directe. Ensemençons largement la surface d'une boîte de Pétri avec une culture de Shiga, déposons de suite en un point une goutte de culture du Bactériophage, plaçons àTétuve; 3 h. plus tard, déposons une seconde goutte en un autre point, puis une trosième après 6 h., une quatrième après 12 h. et une dernière après 20 h. Une quinzaine d'heures plus tard, aux endroits où ont été déposées lés trois premières gouttes, la gélose est libre de culture ; à la place de la goutte déposée après 12 h. on a une légère couche composée de bacilles morts ; à la place de celle déposée à la 20^ h. la couche paraît à peu près normale. Ce n'est d'ailleurs qu'une apparence car les réensemencements pratiqués en prélevant la semence en ce point restent stériles : les bacilles sont tués mais non lysés. Ces cinq taches reproduisent donc en détail les divers aspects de la colonie isolée de Bactériophage, du centre à la périphérie.

La seconde raison est d'un caractère plus général : il s'agit d'un phénomène commun à la généralité des microbes cultivables. Les colonies de Bactériophages se comportent absolument comme des colonies bactériennes quelconques, qui, à l'exception de celles du Proteus, n'envahissent jamais la surface des milieux solides. Ensemençons sur gélose une émulsion de Shiga assez faible pour n'obtenir que quelques colonies isolées : après 18-24 h. chaque colonie aura de 2 à 4 n^n^. de diamètre, les plus grandes se trouvant à l'endroit où la gélose offre une couche plus épaisse, soit vers le fond du tube. La colonie s'accroîtra ensuite très lentement, de plus en plus lentement avec le temps, et après deux mois l'anneau d'accroissement ne sera pas supérieur à quelques millimètres. Il s'est pourtant trouvé des bactériologues à qui il a paru singulier que le Bactériophage n'envahisse pas toute la surface couverte de bactéries, sans penser que, loin d'être en cela dissemblable des autres microbes cultivables, la colonie isolée de Bactériophage se comportait rigoureusement comme une colonie microbienne quelconque. Pourquoi une colonie bactérienne ne continue-t-elle pas à croître jusqu'à envahir toute la surface de la gélose? Parce que les substances solubles résultant de l'activité vitale de la bactérie diffusent dans la gélose et que ces substances constituent de véritables antiseptiques spécifiques qui entravent la culture, le milieu se trouve « vacciné » autour de la colonie ; plus la gélose est profonde, plus les

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colonies sont espacées les unes des autres, plus grand est le volume de substratum où peut se diluer la substance antiseptique, plus grandes sont les colonies. Il en est exactement de même avec les colonies de Bactériophage : plus les colonies sont espacées, plus le substratum a d'épaisseur, plus le diamètre des colonies est grand. Des expériences directes permettent d'ailleurs de montrer que celte interprétation est exacte et que les substances solubles provenant de la lyse^ substances résultant de l'activité vitale du Bactériophage, entravent son action, ralentissent sa culture et empêchent la lyse totale.

INFLUENCE DE LA CONCENTRATION DU MILIEU EN BACTÉRIES. ACTION INHIBITIVE DES PRODUITS DE LA LYSE

Dans toutes les expériences concernant l'action du Bactériophage en milieu liquide, nous n'avons jusqu'ici envisagé que le casd'émulsions renfermant environ 25o millions de bactéries par centimètre cube.

Qu'arrivera-t-il si nous faisons varier le titre de l'émulsion entre 5o et 5oo millions? Le résultat final sera toujours le même, lyse totale, et même le temps au bout duquel la lyse est complète ne varie pas dans des limites fort éteijdues pour une même quantité d'ultramicrobes bactériophages inoculés, vu la rapidité de développement de ces germes. Examinons les deux cas extrêmes.

Exp. — lo L'inoculation en bactériophag-es a été massive, soit i/ôo de cm^ * c'est dans ce cas où la différence de temps est le plus marque.

e de bacilles

par

cm^

Lyse terminée en

5o millions

3oo —

4oo —

5oo —

2^» L'inoculalion en bactériophages a été très faible, soit, dans Texpérience suivante, un millionième de centimètre cube.