partie de ce travail
Coloration des corpuscules métachromatiques
Babès a signalé, en 1885, la présence, chez le bacille diphtérique, de corpuscules métachromatiques ou corpuscules polaires, que l’on peut mettre en évidence par certains procédés de coloration dont voici les principaux.
Le procédé classique est celui qui est dû à Neisser,
DE
On utilise les deux solutions suivantes :
a) Bleu de méthylène......... de TEpr AJCOOL MAN O0 EE EEE COTE Fau-distiliée 7e" rt te SODO ICE:
Acide acétique lplacial. ..:#"18#5o0cc:
D). VÉSUNIREN TR ET R EC EUEE Era D'ABT Eau distillée bouillante. ...... 1 litre.
Emulsionner dans une goutte d’eau versée sur une lame une parcelle d’une colonie âgée de 24 heures sur sérum. Colorer avec la solution a pendant quelques secondes, laver à l’eau, colorer avec la solution b pendant 3 à D secondes; laver à l’eau, sécher.
Les bacilles de Lôüffler sont colorés en brun et portent à leurs extrémités des grains colorés en bleu noir.
Neisser conseille de partir de cultures faites à 35° sur sérum de Lôüffler et âgées de 9 à 20 heures. L'expérience a appris que l’on obtient de bons résultats avec des cultures faites à 37° et qu'il est avantageux de faire agir le bleu de méthylène acétique et la vésuvine beaucoup plus long-
temps qu'il n’est indiqué.
Le même auteur a indiqué un autre procédé de colora-
tion; on utilise trois solutions :
a) Bleu de méthylène... or AGO! 19042 ee DOCS Héadistiliée ner Ame :— 000. (CC:
Acide acétique ..... ART 5o cc,
DCS vil Se AA VI D gr.
AIRPORT mn EC 20 CCC Esudistiilée set, AM 300 EC:
CCS ONNENNEUR RTE A RE TES UN PEURORAN ER ER NU Us 300 CC:
Filtrer.
On colore pendant une seconde avec un mélange de deux parties de solution a et une partie de solution b, on lave et on fait agir pendant trois secondes la solution de chrysoïdine.
Les corps bacillaires sont colorés en jaune verdâtre; les
corpuscules en violet foncé.
Ficker recommande la modification suivante :
On ajoute 2 centimètres cubes d’acide lactique pur à une solution de bleu de méthylène pur à r pour 1000; on met quelques gouttes de cette solution sur une lame, on applique dessus la lamelle portant la préparation de bacilles et on aspire le colorant avec un morceau de papier à filtrer. Les granulations se colorent en bleu foncé, tandis
que les bâtonnets sont presque incolores.
Piorkowski part de cultures à 37° sur gélose glycérinée; il colore pendant & minute avec du bleu de méthylène alcalin, en chauffant légèrement et il décolore ensuite, pendant 5 secondes, par l'acide chlorhydrique à 3%; il lave à l’eau et recolore par une solution aqueuse d’éosine
à 1% pendant 5 minutes,
Van de Rovaart emploie le bleu de méthylène alcalin
pendant 1: minute à r minute à, puis la vésuvine.
Le procédé Falière emploie la solution suivante: =
Bleu-detméthylènen”-CLt 8e SN Bora RTS, MR RTE a Tu A0 200:
Foudistllée ouh Se AL TOO CC:
ARCOOL Abo LE RRMPCUE RRMONES VII gouttes.
Colorer, laver à l’eau, puis colorer le fond avec une
solution de vésuvine à 1 %.
Ljubinsky fait agir sur la préparation préalablement
fixée pendant + à > minutes la solution suivante :
Pyocktinine MAPrEr CR Re 0,25 CC.
ACTIGRACÉAUENANT EEE APRES à FOO CC:
Après lavage à l’eau, on colore & minute avec une solution de vésuvine à 1 %. Les granulations sont colorées en bleu foncé de dimensions considérables se voyant presque dans tous les bâtonnets; les contours des bacilles sont
colorés en violet foncé se dessinant d’une façon très nette.
Ph. Blumenthal et Lipskerow disent beaucoup de bien du procédé de Ljubinski qu'ils préfèrent à celui de Falié-
res : tous deux leur ont donné de bons résultats.
Epstein recommande la méthode suivante :
Colorer pendant 20 secondes avec une solution de pyro-
nine ou avec la solution de bleu de Lôffier pendant une
demi-minute; laver; traiter par la solution de Gram pendant 10 minutes; laver; sécher. D'après l’auteur, la pyronine constituerait le colorant de choix : les corpuscules polaires apparaissent comme des masses arrondies ou ovales d’une couleur sombre rouge brique, tandis que le bacille est habituellement d’un rouge clair. Dans quelques cas, les corpuscules polaires présentent une tache centrale réfringente incolore. Avec la solution de Lôffler, -les corpuscules polaires sont d’un noir verdâtre, les bacilles verdâtres.
Pour E. Gildemeister et Guntha, le procédé de Gins, consistant à traiter les frottis colorés à l’aide de la méthode de Neisser par la liqueur de Lugol renfermant 1% d'acide lactique, présente de réels avantages. Les bacilles ont des contours très nets et les corpuscules polai-
\ res sont colorés avec une grande intensité.
Pour H. Reiter, au contraire, la méthode de Gins ne paraît pas présenter d'avantages sur les méthodes cou-
rantes.
Aviragnet et Le Soudier emploient le bleu de Roux avec
recoloration par la chrysoïdine à 1 pour 300.
Le bleu de Roux a la composition suivante :
Solution aqueuse à 1 % de violet dalhia ..... 1 p. Solution aqueusé à 1 % de vert de méthyle... 3 p. On ajoute assez d’eau au mélange pour avoir une belle
teinte bleue pas trop foncée,
rose
Tribondeau et Dubreuil préconisent la solution sui-
vante :
CIMAL NICOLE NS SES EP Aer Acide phénique neigeux ........ 3 ET, 0 Alcool méthylique ...... PAR Anacé 10 CC.
Badadistilée ACER 70 DEEnOo CC:
Colorer pendant 5 minutes les bacilles émulsionnés dans une gouttelette d’eau distillée, puis desséchés et fixés à l’alcool absolu; laver à l’eau ordinaire; traiter par une solution de vésuvine à r pour 500 jusqu’à virage au brun; laver et sécher; les granulations polaires sont d’un beau
violet noir, le corps des bacilles est jaune.
F. Arloing et G. Richard ont appliqué au bacille diphtérique la coloration vitale au bleu de Nil. Ils ont ainsi obtenu en goutte pendante, au bout de 5 à 10 minutes, avec une solution très peu carcentrée, des bacilles colorés en bleu clair présentant des granulations roses, rouges et même mauves et violettes. La coloration obtenue est variable avec la nature du liquide dans lequel on met les bacilles en suspension : on obtient une coloration rapide et élective en employant l’eau physiologique à 9 p. 1000; les bacilles restent vivants. ;
Enfin, il y a lieu de signaler ici un bon procédé que j'ai employé pour la coloration rapide des granulations avec un seul colorant; il consiste à utiliser une solution de bleu de méthylène additionnée d’acétate d’alumine et
même d'acétate de fer,
5 Diet
dre La formule suivante permet d'obtenir la coloration en
1 minute :
Solution aqueuse saturée de bleu de méthylène 10 cc.
Solution d’acétate d’alumine à 8% ........ 2 {CC PoiHonediacotendéttert a tS lez Li ua o,8 cc. Eau disiillée.q\s{p.-.2.0.44 ns el rues 20 CC.
Avec la seconde formule, donnée ci-après, on obtient
la coloration en 4 minutes :
Solution aqueuse de bleu de méthylène à 1 p. 200 10 gr. Solution d’acétate d’alumine à 8p.100........ 6 cc. CAPES ICO A TE Arr Merelote D CC:
L'addition à cette formule d’une très faible quantité de fuschine permet d'obtenir la coloration des corps de bacille en rouge, tandis que les corpuscules sont bleu
foncé.
La recherche des granulations de Babès comme moyen diagnostique est discutée : si certains auteurs, comme Lesieur, Kaulbach, Graham Smith, Schekler, P. P. Lévy, Debré et Letulle, lui accordent une grande valeur, d’autres font des réserves; certains bactériologues, même, lui
contestent toute valeur (Cathooire, Cadiot et Henry).
D'après Lehmann et Neumann, des bacilles diphtériques virulents se présentent parfois sans corpuscules, de telle sorte que leur absence n'exclut pas absolument le bacille diphtérique; de plus, le faux diphtérique peut
parfois en présenter, ainsi que le bacillus xerosis. Les
PR
, . A Le mêmes auteurs relatent que Neisser lui-même a trouvé 3 échantillons sans corpuscules sur 39 bacilles virulents
typiques dans tous leurs caractères.
« On a voulu attribuer, disent Dopter et Sacquépée, à
ces granulations polaires un caractère différentiel important capable de séparer le bacille de Lôffler des bactéries diphtérimorphes, où leur absence serait la règle. L’expérience montre que, présentes le plus souvent, elles peu-
vent se rencontrer dans les bactéries similaires. »
D'après Lesieur lui-même, qui a réuni dans sa thèse tous les détails techniques relatifs à la méthode de Neisser, 20 % des bacilles non virulents ont des granulations
et 20 % des bacilles virulents n’en possèdent pas.
Rist, qui a beaucoup pratiqué jadis à l'hôpital Trousseau, la recherche des granulations par la méthode de Neisser, dit qu’il y a toujours des cas où elle laisse dans le doute.
Debré et Letulle estiment qu'avec un examén minutieux, on peut voir que les bacilles d’une colonie diphtérique ne sont jamais tous dépourvus de granulations polaires typiques, tandis que les faux bacilles diphtériques n’ont jamais de pareilles granulations bipolaires, à une exception près, celle du bacterium cutis commune.
Au cours de nos recherches nous avons vu que, sur 97 bacilles diphtériques vrais, authentiques, isolés par nous avec le milieu horizon et dûment identifiés, 88 pré-
sentaient des corpuscules polaires nets et abondants, 2 en
à RES
possédaient de nombreux, mais très petits, 7 en étaient dépourvus où n'en possédaient qu'en très faible proportion. Sur 100 bacilles d'Hofmann, 81 en étaient totalement dépourvus, 13 en avaient quelques-uns, 2 en avaient de nombreux mais très petits, et 4 en possédaient de nets
et abondants.
Ljubinski ayant fait l'examen bactériologique de 105 plaies, y a constaté la présence du bacille dipthérique dans 18 cas; dans 46 cas, il a trouvé des bacilles prenant le Gram, renfermant des corpuseules de Neisser, attaquant le saccharose, non pathogènes pour le cobaye et qu'on pourrait confondre avec le bacille de Lôffler; pourtant, il dit qu'ils sont un peu plus épais et plus courts, et qu'ils n'en présentent pas la disposition; ces bacilles, qu'il appelle « para diphtériques », semblent devoir être rattachés, d'après leurs caractères et leur provenance, au
groupe corenvhacterium cutis.
Pergola ayant examiné les différentes méthodes de coloration des corpuscules métachromatiques, conseille de passer les préparations à l’iode pour enlever les granulations noires que le milieu au tellure pourrait avoir fait naître dans les corps bacillaires. D'après cet auteur, parmi les éléments nécessaires aux milieux de culture pour l’apparition , des granulations métachromatiques dans les bacilles diphtériques, il faut citer le jaune d'œuf, la g1y-
cérine, le sérum sanguin et le glucose.
F. Arloing et G. Richard ont pu rendre granuleuses 3
DPI
souches de bacille d'Hofmann en utilisant le milieu horizon additionné d'extrait total de levure de bière ou de lécithine 3 %. Au bout de 24 à 36 heures, on observe des granulations polaires, se colorant vitalement et présentant le phénomène de la métachromasie; ces granulations sont transitoires et ne s’observent parfois plus au bout de 2 à 3 jours; certains individus peuvent garder ce caractère dans les cultures ultérieures faites sur les milieux usuels : ces bacilles ayant acquis des corpuscules métachromatiques restent dépourvus de virulence.
Pour conclure, nous dirons que la recherche des corpuscules polaires ne constitue pas une méthode rigoureuse qui permette le diagnostic différentiel entre le bacille de Lôüffler et le bacille d'Hofmann; en effet, elle est en défaut avec le premier dans bon nombre de cas, elle s’observe parfois, au contraire, avec le second; enfin elle ne permet pas non plus d'éliminer le bacillus cutis commu-
nis qui présente, lui aussi, des corpuscules polaires.
Décoloration par l’alcool
En 1913, Roch et Meros ont employé, pour différencier le bacille de Lôffler du bacille d'Hofmann, la résistance variable qu’offrent ces microbes à la décoloration par l’alcool lorsqu'on les a colorés par la méthode de Gram : en général, le premier garde sa coloration pendant plus d’une minute, mais finit par se décolorer, tandis que le second reste coloré après 10 minutes de contact avec
l’alcool.
