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point d'application sur une culture d’un microbe sensible, une zone d'inhibition de 24 mm.
Le seconde, l'unité OxFoRD, est la quantité minimum de Pénicilline qui, dissoute dans 50 ec. de bouillon de viande, inhibe complètement la croissance d’une souche type de Staphylocoque doré.
Cependant à Londres, en 1944, se tint l’«/nternational Conference on Penicillin» qui définit l'unité internationale.
L’étalon international de Pénicilline est l'équivalent de 6 dix millièmes de milligramme du sel sodique pur cristallisé de Pénicilline G.
Aujourd’hui, vu l’extension du nombre des Antibiotiques en thérapeutique et pour faciliter les choses, on a tendance à considérer simplement le poids de l’Antibiotique. C’est ainsi qu’actuellement on parle par exemple de mmg. de Streptomycine ou d’Auréomycine et non pas d'unités.
2° Le matériel utilisé, a) La bactérie-test:
La bactérie sensible utilisée est un Staphylocoque. T] existe un grand nombre de souches staphylococciques différentes, variant par leur origine ou leurs propriétés.
En Amérique on a coutume de faire appel à la souche 209 de l'American Typ Culture, collection de Washington. En Angleterre et généralement en Europe, on emploie la souche 6571 NRRL de l'Institut Lister de Londres. En France on se sert de la souche 133 de l'Institut Pasteur.
L’âge de la souche choisie a une grande importance. Le vieillissement d’une culture provoque une diminution de vitalité, une diminution de virulence du germe considéré, une variation de sensibilité vis-à-vis des Antibiotiques. Or, il est essentiel que l’on ait des résultats comparables et constants. C’est la raison pour laquelle on emploie une souche de Staphylocoque, âgée de 24 heures.
Cependant le Staphylocoque doré n’est pas la seule bactérie-test utilisée.
De nouvelles méthodes remplacent ce germe par le Bacillus subtilis. Elles sont dues à AHERWOOD, FALCO et DE BEER (2) et à FOSTER et WOODRUFF (3).
L'avantage que présente l’utilisation du B. subtilis est certain, puisque cette bactérie non pathogène met à labri d’une infection le manipulateur imprudent ou maladroit, infection toujours possible avec le S. doré et d'autant plus grave qu’il existe un grand nombre de souches pénicillino-
résistantes.
D’autre part, les spores de ce germe se conservent pendant longtemps et elles peuvent être incorporées dans la Gélose sans qu’un refroidissement préalable soit nécessaire. Enfin, le B. subtilis pousse assez rapidement et ce fait diminue le temps de l’expérience. :
De son côté, WiLsoN propose une méthode de titrage rapide, basée sur l’inhibition exercée par la Pénicilline sur la croissance d’un Sfreptocoque hémolytique B du groupe A.
b) Le milieu:
Le milieu de MarTrIN et Nirri est le milieu classique qui doit être utilisé:
PÉDIORENUCIA EEE RE ES RENTE 20 gr.
Chlorure desodiumi 2e 5 gr.
Glucose ne Tea RATE 2 gr:
AUS. D AIN TER Re eee 1.000 cc.
Ajuster à pH 7,5 au moyen de Lessive de soude. Stériliser à 120° pendant 30 minutes. Vérifier le pH. Ajouter le glucose et distribuer en tubes de taille identique à raison de 10 cc. par tube. Boucher au coton et stériliser à 110° pendant 30 minutes.
Etant donné l’inconstance des Peptones de fabrications diverses et l'importance de la composition du milieu lors des titrages, SARTORY et MEYER (4) ont élaboré un milieu strictement synthétique, permettant d’obtenir des résultats toujours comparables et satisfaisants en ce qui concerne la culture des Staphylocoques.
Glycérophosphate de fer ...... 0,05 gr.
Phosphate dipotassique ......... 0,50 gr.
Chlorure de sodium ............ 3,00 gr.
Bromure de potassium .......... 0,50 gr.
Chlorure de magnésium ........ 0,50 gr.
Chlorure d’ammonium ......... 3,00 gr.
Ghicôse. CNP RES 3,00 gr.
GiVéérine rene re RRES 10,00 gr.
Amidenicotiniques ne 0,04 gr.
Vitamibe B, NME) A ae 0,04 gr.
Tryÿptophane te ee Rent 0,20 gr.
ASparagine "FORMES" "RRNRRNREES 0,50 gr.
Leucine. ME NSAROERRNRES 0,20 gr.
Eau “distillée TMNNNANANERNES SES 1.000 cc.
Ajuster à pH 6,4. Stériliser à 120° pendant 15 minutes.
Les facteurs de croissance étant détruits assez facilement par une stérilisation trop élevée, on a intérêt à préparer avec ces produits des solutions tyndallisées qui seront ajoutées après la stérilisation avec toutes les garanties d’aseptie nécessaires.
DR a ©) L’étalon de Pénicilline:
. La solution-étalon de Pénicilline doit être préparée à raison de 50 U. par cc. avec la solution tampon suivante:
Phosphate monopotassique ..... 1,17 gr.
Phosphate disodique cristallisé .. 0,50 gr.
ANR RIT mere iNtl a Sh, Digi 100 ce.
x On obtient une solution tamponnée de pH := 6 qui peut être stérilisée en y ajoutant une trace de Chloroforme ou de Toluène.
TITRATION PAR DIFFUSION.
Les méthodes de dosage par diffusion sont applicables seulement quand il s’agit d’Antibiotiques hydrosolubles. Elles sont à rejeter si l’on a affaire à des composés insolubles dans l’eau. ;
1° Méthode de Heatley (dite d'Oxford).
Cette méthode, dont les détails ont été précisé par HEATLEY (5) a servi aux investigations de ABRAHAM, CHAIN et leurs collaborateurs (6).
On utilise de petits tubes en verre ayant les dimensions suivantes: 10 mm. de profondeur, 8 mm. de diamètre extérieur et 6,5 mm. de diamètre intérieur. L’une de leurs extrémités est rodée. Ces tubes sont implantés à la surface d’une couche de Gélose solidifiée dans une boîte de PÉTrRI.
Il est préférable d'utiliser à la place de la Gélose, soit le milieu synthétique de SarTORY et MEYER, solidifié par addition de Gélose dans la proportion de 15 pour 1.000, soit le milieu de MARTIN et Nirri:
Autolysat de levure Byla ....... sp DÉRLODEANCIA EEE a bac tee 6 gr.
CICOSS NN SE Ne ef ss. 1 gr.
Chloruresde! sodium. .......... 5 gr.
PROS CRE CRE PE M ET AE ere 15 gr.
D'ANECAS AD TE erA. ic". 1000 cc.
Dissoudre à chaud le Chlorure de sodium, lAutolysat et la Peptone dans l’eau. Ajouter la Gélose. Ajuster à pH 7.2
Stériliser pendant 30 minutes à 120°. Filtrer dans l’autoclave bouillant et ouvert. Ajouter le Glucose dissout dans 10 cc. d’eau. Mélanger, répartir à raison de 20 ec. par tube. Stériliser à 110° pendant 30 minutes.
Pet Le TE Technique:
Faire fondre au bain-marie quelques tubes de milieu solide, laisser refroidir aux environs de 45-50°, ensemencer au moyen d’une culture de Staphylocoque type en milieu liquide âgée de 24 heures.
Préparer au préalable des boîtes de PÉrRI contenant le milieu gélosé cité ci-dessus, coulé en couche mince. Laisser refroidir et porter ces boîtes retournées à l’étuve à 42° pendant deux heures pour réaliser la dessiccation.
Prélever 2 cc. du milieu ensemencé précédemment et couler ce prélèvement à la surface d’une boîte de PÉTRI contenant la Gélose solidifiée et desséchée. Etaler rapidement ces 2 cc. de milieu ensemencé, placer en position horizontale et laisser la solidification s’opérer.
Introduire dans chaque boîte 5 anneaux stérilisés préalablement au four, et les poser verticalement sur la Gélose.
Répartir dans 3 anneaux le prélèvement à examiner. Les deux autres sont réservés à la solution de Pénicilline-étalon.
Placer à l’étuve à 37° pendant environ 18 heures et mesurer à ce moment le diamètre des zones d’inhibition. Rapporter les mesures obtenues au moyen du prélèvement à examiner à celles fournies par la solution-étalon de Pénicilline.
On prépare de la même façon plusieurs boîtes en utilisant chaque fois une autre dilution de prélèvement à examiner et de Pénicilline-étalon.
Pour l'interprétation et l’établissement du résultat, on choisira les deux dilutions qui présentent un pouvoir de diffusion identique.
Il est admis qu’une unité HEATLEY provoque la lyse sur une surface de 24 mm. de diamètre.
Certains facteurs influent sur l’étendue des zones d’inhibition. Tels sont, d’après Scamipr et MoYER (7), l'épaisseur de la couche de Gélose, son pH, la quantité d’inoculats bactériens, la réfrigération préalable, etc...
Ajoutons que, d’après les mêmes auteurs, on peut incorporer le Sfaphylocoque dans une couche de 3 mm de Gélose, que l’on verse à la surface d’une autre couche, d’Agar-agar, dont l’épaisseur est de 20 mm.
Remarque:
Vu la diminution de l’activité de la Pénicilline à 37°, on a intérêt à mesurer les zones d’inhibition de croissance aussi rapidement que possible. On examinera donc ces cultures déjà au bout de 12 à 16 heures pour tirer, si possible, des conclusions.
A ce point de vue, il est recommandable de placer au début les boîtes de PÉrRI ensemencées et pourvues de Péni-
cilline à la glacière pendant plusieurs heures avant de les
DAT DU ee
disposer à l’étuve. La diffusion de la Pénicilline s'effectuera pendant ce premier temps, et son action se manifestera au moment du passage à la température de 37°.
Pour l'interprétation des résultats, on construira avec avantage une courbe traduisant la relation entre le diamètre des zones d’inhibition en millimètres et les concentrations connues des solutions-étalon de Pénicilline. On lira sur la courbe la concentration en unités de Pénicilline d’une solution de titre inconnu en étude.
2° Méthode des disques de papier (dite d’Oxford-Cup).
C’est à VINCENT (8) que l’on doit la mise au point de cette technique, sensiblement plus simple et plus commode que la précédente.
En voici les détails: de la Gélose préalablement fondue, est versée dans des boîtes de PÉTRI, puis séchée. Des disques de papier-filtre de 7,5 mm de diamètre sont, après stérilisation préalable, imbibés de solutions diverses de Pénicilline, puis appliqués à l’aide d’une pince fine à la surface de la Gélose ensemencée au préalable avec une culture de Staphylocoque âgée de 24 heures. On place les boîtes de PÉrei à 37° et l’on fait la lecture après 20 heures. Il apparaît autour de chaque rondelle un disque lysé clair, transparent, contrastant avec le reste de la Gélose qui reste opaque. Le calcul (comme dans la méthode précédente) du diamètre de cette zone lysée, et la comparaison opérée dans les mêmes conditions, avec une Pénicilline-étalon, permettent d’évaluer l’effet antibiotique.
Cette méthode, applicable également à la recherche de la Pénicilline dans le sang, l’urine et le liquide céphalo-rachidien, a été amélioré par EPSTEIN, FOLEY, PERRINE et LEE, en ce sens que les auteurs préconisent l’emploi de grandes boîtes de pyrex de 31,75 cm. sur 26,30 cm., dans lesquelles on introduit 147 ce. de Gélose, ensemencée au préalable avec du Staphylocoque. Les disques de papier utilisés mesurent 1 cm. de diamètre. On peut en placer un assez grand nombre sur la même surface d’Agar-agar.
3° Méthodes utilisant le «Bacillus subtilis» en tant que Test.
Ces méthodes sont dues à AHERWOOD, FALCO et DE BEER (1) et à Foster et Wooprurr. Les premiers de ces auteurs ensemencent de la Gélose avec une suspension de spores de Bac. subtilis, de manière qu’elle contienne 2 M 10° spores par centimètre cube. On introduit 25 ce. d’une telle Gélose ensemencée dans des boîtes de PÉTRI, afin que l'épaisseur atteigne 4 mm. Des disques de papier, d’un diamètre de 15 mm. sont
PAL. (ee
imbibés de dilutions variables de Pénicilline à l’aide d’une anse en fil de nickel de 4 mm.
Etuvage à 37° pendant 5 heures {/2 et lecture. Mesure des zones d’inhibition et par conséquent titrage. Quant à FOSTER et WOODRUFF, ils se servent également du B. subtilis comme test, mais s’adressent au procédé des tubes en verre de HEATLEY.
4° Méthode des stries ou des gouttières.
Cette méthode offre un caractère plus qualificatif que quantitatif. Elle a été utilisé par FremNa (10) et vérifié bon nombre de fois depuis. On coule de la Gélose fondue dans une boîte de PÉTRI et après solidification et séchage à 37°, on pratique, soit latéralement, soit au milieu, une gouttière à l’aide d’une baguette de verre préalablement chauffée. De la Péniciliine est versée dans cette gouttière, sur le bord de laquelle, et perpendiculairement, on ensemence les microbes dont on désire éprouver la sensibilité à la lyse. Le principe diffuse excentriquement et arrête ainsi la pousse des germes vulnérables.
5° Méthode au Nitrate d’argent.
Ce procédé permet la réduction de la phase d’incubation de la Pénicilline sur le Staphylocoque à 3 heures seulement.
Il est basé sur le fait que les cellules normales du Sfaphylocoque et celles qui sont influencées par la Pénicilline manifestent une affinité RCE envers une solution aqueuse de Nitrate d'argent.
Technique:
Préparer et ensemencer les boîtes de PÉTRI.
Ajouter la solution de Pénicilline à doser et placer à l’étuve à 37° pendant 3 heures.
Verser sur les plaques une solution de Nitrate d'argent et éclairer fortement.
Mesurer le diamètre des zones d’inhibition qui deviennent visibles après addition d’un révélateur.
Cette méthode se prète pour des concentrations en Pénicilline de 1 à 8 unités par cc.
Sa courbe d'étalonnage est linéaire.
TITRATION PAR DILUTION.
1° Méthode classique des dilutions progressives.
. Cette méthode indique le titre de la solution pénicillinique minima active. Elle consiste à préparer des dilutions de Pénicilline de 10 en 10 dans un bouillon nutritif, et à les ensemencer avec une quantité donnée de Staphylocoques.
Technique:
Préparer une série de tubes contenant 4,5 cc. de bouillon et ajouter au premier tube 0,5 cc. de Pénicilline à titrer. Agiter puis verser 0,5 cc. du mélange dans le tube suivant et ainsi de suite. Ensemencer en ajoutant à chaque tube 0,5 cc. (ce qui ramène le volume total à 5 cc.) d’une culture en bouillon de Staphylocoques âgée de 24 heures, à la dilution de 10—*. Placer les tubes à 37° et faire la lecture des résultats après 20 heures. Il est important de considérer seulement les tubes dans lesquels toute la culture est entravée et de ne pas tenir compte de ceux présentant une faible pullulation microbienne.
On peut serrer davantage le titrage en préparant des dilutions de 5 en 5 ou de 2 en 2 suivant les nécessités de la précision. Ce titrage permet par un simple calcul d'évaluer la teneur d’une Pénicilline en U. O.
2° Méthode des «cultures cellulaires».
HEILMANN (11) propose un procédé, semble-t-il très pratique, permettant d'éviter l’utilisation, pour le titrage, d’une Pénicilline-étalon. On introduit dans des flacons du modèle de ceux utilisés pour les cultures cellulaires, du plasma et de l'extrait d’embryon de poulet, auxquels on ajoute une dilution de culture de Pneumocoque type VIT (de façon que l’on obtienne 20 colonies) et aussi de la Pénicilline à titrer, Sera considérée comme dilution-limite, celle qui entrave la pousse du Pneumocoque dans 4 flacons similaires. Les résultats apparaissent rigoureusement exacts, paraît-il.
3° Méthode de Sureau et Chabert.
Ces auteurs emploient une méthode de titrage de la Pénicilline en présence de Glucose et de Phényl-sul/one-phtaléine introduit dans un bouillon (12). La croissance du Sta-
phylocoque ou d’un autre microbe utilisé comme test amène
