API EE
la fermentation du Glucose avec acidification et par suite le virage de l’indicateur de pH utilisé.
Pour cette méthode on utilise le bouillon suivant:
Solution de glucose à 30% ........ Liice.
SOMUGN Ie RS PES ESA 0,5 cc.
Bouillonépeptonet. 0, Smet nn 8,5 cc.
Technique:
Verser dans une série de tubes des quantités égales de ce milieu Glucose — P.S.P.
Ensemencer avec une culture en bouillon de Staphylocoque âgée de 24 heures à la dilution de 1%.
Ajouter des concentrations croissantes du prélèvement à titrer. Placer à l’étuve à 37° et examiner à partir de la 12° heure.
Simultanément on fait les mêmes opérations au moyen d’une solution de Pénicilline de titre connu.
Interprétation:
Dans les tubes pour lesquels une croissance du Staphylocoque a encore lieu, le milieu devient acide par suite de la fermentation du Glucose et l'indicateur vire du rose franc au jaune citron.
La dilution intermédiaire entre les deux tubes voisins, l’un rose, l’autre jaune, est la dilution limite de Pénicilline inhibant la croissance du Staphylocoque.
4° Méthode de Prévot.
Cette technique présente plusieurs avantages et elle a été avant tout conçu pour le titrage de la Pénicilline en anaérobiose. Elle est basée sur le principe de la décoloration par réduction d’un indicateur d’oxydo-réduction introduit dans le milieu de culture.
Le milieu de culture à prendre en considération est le suivant:
Bouillon? glucose PRE EE ENT 700 cc.
Solution tampon aux Phosphates de pH 7,2 300 cc. Solution d’indicateur à 0,01 p. 1000 ...... 10 cc.
Comme indicateur on utilise soit le Bleu de méthylène, soit le Bleu de crésyl brillant. Par l’autoclave, le milieu se décolore et devient jaunâtre; on attendra pour l’emploi le retour vers l’équilibre d’oxygénation.
Technique:
Préparer une gamme de tubes contenant du milieu ensemencé et des quantités croissantes de Pénicilline,
A 1e VAR
Cette gamme est placée à l’étuve à 37°, contrôlée à partir: de la 3° heure et ensuite toutes les heures.
Il est essentiel de ne pas agiter les tubes au cours de ces manipulations.
La lecture s’effectue dès que le témoin se décolore. Le premier tube non décoloré de la gamme en expérience indique la quantité de Pénicilline inhibitrice.
9° Microméthode au Soludagénan.
Cette méthode (13) est d’une sensibilité très prononcée et peut servir au dosage de traces de Pénicilline. Elle est basée sur le fait que l’activité de la Pénicilline est renforcée par les Sulfamides.
Technique:
Placer dans une boîte de verre carrée des séries de petits tubes de verre:
Verser dans chacun d’eux 1/20° de cc. de milieu solide à la température ordinaire et stériliser.
Ensemencer avec 1/200° de cc. de culture de Staphylocoque âgée de 24 heures à la dilution de 1%c.
Diluer 70 fois le contenu d’une ampoule de Soludagénan et ajouter une goutte (1/200 cc.) de cette solution.
Préparer une gamme de dilution de la solution de Pénicilline à doser en la diluant 2 fois, 4 fois, 8 fois, etc.
Ajouter dans une série de tubes au moyen d’une pipette graduée au 1/200° de cc. par goutte, 10 gouttes de chacune de ces solutions.
Préparer parallèlement une série semblable avec une solution de Pénicilline de titre connu en partant de 0,5 U. par cc. et des témoins sans Pénicilline avec et sans Soludagénan.
Placer à 37° pendant 24 heures et comparer la série inconnue en expérience à la série étalon.
Les deux premiers tubes dans lesquels on peut constater une croissance du Staphylocoque présentent la même concentration en antibiotique.
Cette méthode peut déceler des quantités de Pénicilline allant de 1/100 jusqu’à 1/1000 d'unité par cc.
6° Méthode opacimétrique.
Inaugurée par FosTER (14), cette méthode est basée sur le titrage opacimétrique du degré de turbidité qui se produit dans les tubes où on effectue l'évaluation de l'effet bactériostatique. En voici quelques détails:
Joszyx (15) ajoute dans 8 tubes de bouillon une solutionétalon de Pénicilline-test, de manière à obtenir des concen-
AN. reel
trations variant de 0,005 à 0,035 U.O. par cc. Une série semblable est réalisée avec une Pénicilline de valeur inconnue. Ensemencement avec une culture de Streptocoque et mainüen à 37° pendant 4 heures. Mesure de l’opacité par le colorimètre photo-électrique. La comparaison des courbes d’opacité des deux séries indique la teneur de la Pénicilline en U.O0. De son côté, Mc Maan (16), qui opère sur des séries de 12 concentrations, conseille d'arrêter la lyse au bout de 4 heures, par chauffage à 100°.
7° Méthode utilisant le Streptocoque hémolytique comme «test».
WILSON (17) propose une méthode de titrage rapide basée sur l’inhibition exercée par la Pénicilline sur la croissance d’un Streptocoque hémolytique B du groupe À.
On dilue la Pénicilline à titrer à la concentration de une U.O. par milligramme, et, à partir de cette dilution, on en réalise d’autres renfermant de 0,2 à 0,1 cc., que l’on verse dans des tubes contenant du bouillon.
À ces tubes on ajoute 500 à 700 X 105 de Streptocoques lavés et 0,8 cc. d’une suspension d’hématies de mouton. Séjour à 37° après agitation.
La lecture de l’hémolyse est faite après centrifugation. Le degré de cette hémolyse est inversement proportionnel à l'effet antibiotique de la Pénicilline.
8° Méthode de Fontanellaz au Bleu de bromothymol en milieu glucosé.
Cette méthode a été mise au point par P. FONTANELLAZ dans le laboratoire de Microbiologie de la Faculté de Pharmactie, de Strasbourg.
Elle permet la détermination de 1/125 d’'Unité de Pénicilline.
Technique:
Une série de tubes contenant chacun 2 ce. de milieu au Bleu de bromothymol glucosé est ensemencée au moyen de 0,5 ec. d’une culture en bouillon non glucosé de Staphylocoque doré, âgée de 24 heures, diluée préalablement au moyen de son volume de Soluté isotonique de Chlorure de sodium.
Ajouter des quantités croissantes de prélèvement à titrer et ramener le volume total dans tous les tubes à égalité au moyen de Soluté isotonique.
N’ajouter dans les tubes témoins que du Soluté isotonique sans Pénicilline.
.. La même opération effectuée avec une solution de Pénicilline de titre connu constitue l’étalonnage,
QE
Laisser ineuber 18 heures au moins et examiner ensuite les gammes. Les tubes dans lesquels le développement des Staphylocoques a été inhibé n’auront pas changé de couleur.
Comparer la série étalon avec la série de titre inconnu. Les deux premiers tubes restés verts présentent la même concentration et indiquent par lecture directe le titre en Pénicilline du prélèvement en expérience.
