LES METHODES DE DOSAGE CHIMIQUES ET PHYSIQUES

Les méthodes de dosage biologiques de la Pénicilline que nous venons d'étudier dans la partie précédente de notre travail, nécessitant une grande habitude, sont en somme toutes trop compliquées pour être utilisées dans le laboratoire d’un pharmacien. Ne pratiquant ces dosages qu’occasionnellement, il lui est impossible d'entretenir continuellement, ou de se procurer chaque fois des souches fraîches de Bactéries nécessaires. D’autre part on peut reprocher à ces méthodes leur longue durée et le fait qu’elles nécessitent l'exécution de deux dosages parallèles, lun avec le prélèvement à titrer et l’autre avec une solution-étalon.

Grâce à la pureté des Pénicillines d'aujourd'hui et aux connaissances que l’on a sur leurs caractères chimiques, différents procédés de dosage chimiques ont été élaboré. Ils ne présentent pas les désavantages cités ci-dessus, mais ils pèchent par d’autres inconvénients.

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Une de ces difficultés réside dans le fait que chaque groupe de Pénicilline se comporte différemment pour chaque série de réactions. Il est donc essentiel de savoir quelle sorte de Pénicilline on doit titrer, s’il s’agit d’une Pénicilline G, X, F ou K.

D’autre part ces réactions sont souvent gènées par des substances secondaires présentes dans les préparations de Pénicilline.

1° Méthode iodométrique.

Cette technique est basée sur le fait que les sels de Pénicilline ne sont pas oxydés par l’Iode, tandis que le produit de l’hydrolyse alcaline, tel que le sel de sodium de l’Acide pénicilloïque, consomme une certaine quantité d’Iode.

La méthode détermine tout d’abord la consommation d’Iode d’une solution de Pénicilline intacte et ensuite celle d’une solution hydrolysée au moyen de la Soude diluée. La différence des quantités d’Iode consommées par la Pénicilline intacte et hydrolysée correspond à l’oxydation du produit d’hydrolyse.

Préparer 5 ce. d’une solution de Pénicilline contenant environ 0,6 mg. par cc. ajouter 5 cc. de Lessive de soude normale et laisser en contact pendant 15 minutes à lat ordinaire.

Ajouter ensuite 5 cc. d’Acide chlorhydrique 1,1 normal (une légère acidité est favorable à l'oxydation par l’Iode), puis 15 cc. d’Iode 1/100 normal et laisser de nouveau en contact pendant 15 minutes.

Titrer finalement l’excès d’Iode par une solution d’Hyposulfite de soude 1/100 normal en présence d’Amidon.

Effectuer un essai à blanc sans faire agir au préalable de la Soude et de l’Acide, sur une même prise de Pénicilline avec la même solution d’Iode.

La quantité d’Iode consommée par les produits d’hydrolyse de la Pénicilline qui se trouvait intacte dans l’échantillon, est indiquée par la différence entre les deux résultats.

On a déterminé par l'expérience que le produit d'hydrolyse de 1 mg. de Pénicilline G cristallisée consomme 2,52 cc. d’lode 1/100 normal. ;

La méthode iodométrique permet avec une bonne précision d'effectuer des dosages, s’il s’agit de Pénicilline G très pure, cristallisée et si l’on se place toujours dans les mêmes conditions de travail.

Dans le but de pouvoir appliquer cette méthode à la Pénicilline impure aussi et de la rendre moins empirique, WiLp l’a perfectionnée (18).

D’après lui, l'absorption d’Iode par le produit d’hydrolyse de la Pénicilline est influencée par la température, la concentration en Jode et en lodure de la solution, par le pH du dernier titrage, et par la présence d’impuretés dans l'échantillon à titrer.

2° Méthodes à la Pénicillinase.

Ces méthodes utilisent le principe suivant:

Par l’action de l’enzyme Pénicillinase purifiée, sur la Pénicilline, celle-ci est inactivée avec libération d’un groupé carboxyle.

Il s’agit donc en principe de techniques à la fois chimiques et biologiques.

Une première méthode (19) titre cette acidité par la Soude. Il y a correspondance entre l’acidité et la quantité de Pénicilline l'ayant produite.

. Une autre (20) mesure la quantité équimoléculaire d'Anhydride carbonique qui est libéré, grâce à la présence d’un tampon au Bicarbonate de sodium.

Ces méthodes ne sont rigoureuses que dans des conditions nettement définies, en ce qui concerne le pH des solutions à examiner.

3° Méthode gravimétrique.

On prépare d’après MERCK (21) une solution de Pénicilline à l’état d’acide libre dans l’Acétate d'amyle, en acidifiant au moyen d’Acide phosphorique. Cette solution, diluée par l’Acétone, fournit avec la base pure de N-éfhyl-pipéridine un précipité cristallin, spécifique de la Pénicilline à doser.

Celui-ci est pesé après filtration, lavage et dessiccation dans le vide.

Pour que cette méthode donne de bons résultats, il faut que l’échantillon contienne une proportion de 80% de Pénicilline G au moins, et qu’il soit relativement pur.

4° Méthode colorimétrique.

Cette technique (22), peu précise, utilise le principe suivant: la Pénicilline réagit avec la N-{-naphtyl-+-azobenzèneéthylène-diamine en formant un colorant combiné, dont on mesure colorimétriquement l’intensité après élimination du réactif en excès.

5° Méthode polarimétrique.

Le pouvoir rotatoire d’une solution très peu colorée de Pénicilline relativement pure peut servir pour y doser la Pénicilline (23).

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On détermine le pouvoir rotatoire de l’échantillon de Pénicilline à doser en solution aqueuse à 2% environ par rapport au pouvoir rotatoire d’un étalon du sel de sodium de Pénicilline G pure, employé dans les mêmes conditions. La valeur rotatoire spécifique de ce dernier est de — 298° (5°):

Les produits de décomposition de la Pénicilline n’ont pas d'influence visible sur son dosage même.

6° Méthode spectrophotométrique.

Cette méthode est basée sur le fait qu’une solution de Pénicilline hydrolysée présente une courbe d'absorption dans les longueurs d’ondes de 2700 — 3700 À avec un maximum de 3220 À. Une solution de Pénicilline intacte n’absorbe que très peu dans ces conditions.

Technique: (24)

Hydrolyser la moitié de l'échantillon à titrer au bainmarie bouillant.

Mesurer au moyen d’un Spectrophotomètre les extinctions de la solution hydrolysée et non hydrolysée.

Comparer la différence avec l'extinction d’une solutionétalon de Pénicilline traitée de la même manière.

Cette méthode nécessite un spectrophotomètre très sensible et ne peut s’appliquer qu’à des Pénicillines relativement pures.

7° Méthode de Fontanellaz au Perchlorure de fer.

Cette méthode a été également mis au point par P. Fox- TANELIAZ dans le laboratoire de Microbiologie de la Faculté de Pharmacie de Strasbourg.

Principe:

On fait une titration directe de la Pénicilline au moyen d’une solution très diluée de Chlorure ferrique en présence de Phénol comme indicateur. La fin de la réaction se traduit par une floculation en amas denses et compacts. Ce stade de la réaction a été appelé phénomène de clarification.

Cette méthode permet le dosage du degré d’hydrolyse de la Pénicilline jusqu’à 50%.

Des sels ionisés tels que le Chlorure de sodium occasionnent le changement des résultats, mais ceux-ci varient en rapport direct avec les valeurs des solutions aqueuses pures ou glucosées et ne diminuent pas la fidélité de la méthode.

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Pour qu’elle donne des résultats rigoureux, il faut que la solution à titrer contienne avant l’hydrolyse au moins 2000 U. de Pénicilline par cc., que le pH soit d’environ 5,5 et qu’il n’y ait pas de substances tampon.

Technique:

Ajouter à la solution de Pénicilline à doser une goutte de Phénol liquéfié par ce de liquide, que l’on obtient à la fin de la titration (volume de la solution de Pénicilline + volume probable de la solution de Chlorure ferrique nécessaire à provoquer le phénomène de clarification).

Ajouter au moyen d’une microburette jusqu’à clarification goutte à goutte en agitant, une solution de Chlorure ferrique de titre exactement connu, d'environ 0,1% vol. FeCIE + 6 H°0, soit 0,21 mg. de fer par cc. préparée au moment de l’emploi en diluant 500 fois le soluté officinal de Perchlorure de fer de 50% FeCF + 6 H?0.

Le calcul des résultats s'effectue au moyen ‘des indices déterminés une fois pour toutes, par l'expérience, et variables selon le véhicule contenant la Pénicilline.