TIQUE

l'augmentation produite par cette adrénaline surajoutée, et, de celle-ci, on déduit la quantité d’adrénaline contenue dans l’extrait pur.

De cette facon, les colorations sont produites dans des conditions identiques, et par conséquent parfaitement comparables, même dans le cas d’extraits légèrement colorés. Nous avons eu l’occasion de constater que certaines substances (alanine, créatinine, etc...), sans produire par ellesmêmes de réactions colorées avec l’iode, peuvent pourtant modifier l'intensité de la teinte due à l’adrénaline. Si donc l'extrait renferme de telles substances, les dosages seront erronés.si l’on emploie la méthode colorimétrique usuelle; ils seront exacts si l’on a recours à la méthode de comparaison de G. Weller.

Réaction au sublimé

L’adrénaline donne avec le bichlorure de mercure une coloration rouge. Cette réaction avait été signalée en premier lieu par Mühlmann. G. Comessati [13] précisa en 1907 la facon de la pratiquer. G. Denigès [14] l’améliora en conseillant de l’effectuer en présence d’acétate de sodium. Enfin ©. Bailly {5}, en 1924, publia une méthode de dosage de l’adrénaline dans les poudres de surrénales, basée sur cette réaction.

Méthode de O. Bailly.

Nous reproduisons le texte de l’auteur :

A. — Introduire successivement dans une fiole jaugée de 100 cm° :

Poudre de SUTTENAlCS MER PC EINNNNS 1Bbr DOMAINES EEE ROME VAE RTE 1 cmè Paurdistiliée ORNE ET ES 5 cmÿ

Laisser macérer 1/4 d'heure en ayant soin d’agiter fréquemment, compléter à 100 cm° avec Q.S. d’eau distillée

Lo pe

et laisser encore 1/4 d'heure en contact, en agitant de temps en temps, filtrer.

B. — D'autre part, introduire dans un tube à essai :

AICELALE der SOURCE RENE 4 gr.

Hausse et Meuse 8 cm Agiter jusqu’à dissolution, puis ajouter :

RALOTA LICE de SSU SAN TE RE e PRE 2 cm

Mélanger et ajouter :

Soluhontde HoGi rs Per PA RER RUE III gouttes

Mélanger à nouveau.

Il ne tarde pas à apparaître une belle coloration rouge qui atteint son maximum d'intensité au bout de 3 minutes environ et qui est même suffisamment intense et stable pour se prêter à un dosage colorimétrique par comparaison avec la solution d’adrénaline suivante de titre connu :

ATEN AINEMDUrE ME er en Ce CU 0 gr. 01 SOSHEN RENE AURAS JE Au” ASIE 1F:em° HAUSSE OMS DOUTE PT EP ARE 100. cmè

Cette méthode donne des résultats très satisfaisants. C’est pourquoi, la Commission chargée de la rédaction du Codex [19] a prescrit de l’employer pour le dosage de ladrénaline dans les poudres de surrénales.

APPLICATION AUX GLANDES SURRÉNALES FRAICHES. — M. Paget et P. Lohéac [25] ont publié une application de la méthode de O. Bailly aux surrénales fraîches. M. Paget a modifié cette technique en 1931 [24].

A. Leulier avec G. Mourriquand, avec P. Gojon, et avec L. Revol !21, 22 et 23] a également utilisé cette méthode pour les capsules fraîches. Il opère ainsi :

A) Extraction : Une prise d’essai de O0 gr. 40 à 1 gr. est broyée avec 2-3 fois son poids de sulfate de soude anhydre et mise dans une éprouvette de 20 cm° avec 2 cm° de

SO1H? . et 8 cm* d’eau distillée. On agite. Après 15 minu-

HANG): Del

tes on complète à 20 cm’, on agite, un quart d’heure après on filtre.

B) Dosage proprement dit : 2 cm° du filtrat sont mis dans un tube à essai contenant 1 gr. d’acétate de sodium et 8 cm° d’eau distillée. On agite. On ajoute 5 gouttes de CPHg à 5 %. On mélange, on laisse en contact 25 minutes. Il se produit une teinte rose qui passe au rouge s’il s’agit de médullaire.

Vingt minutes après la mise en train de cette coloration, on prépare un témoin avec 2 cm° de solution T (adrénaline à 1/10.000 dans SO‘H? N/100) 8 cm° d’eau distillée et 5 gouttes de Cl’Hg. Au bout de 3 à 5 minutes, on filtre les liquides, ou bien on centrifuge, et on compare au colorimètre.

CRITIQUE. — a) Extraction : Nous croyons que l’épuisement n’est pas complet dans cette technique employée pour les surrénales fraîches. Il est très difficile d’entraîner l’adrénaline totalement. On ne peut y arriver qu’au moyen d’une solution fortement acide et en répétant les épuisements. Si la technique de O. Bailly donne de bons résultats pour les surrénales desséchées, on ne peut a priori en déduire qu’il en est de même avec les glandes fraîches.

Léon Binet et G. Weller [121 ont publié à ce suiet les résultats de leurs recherches. Ils les relatent ainsi :

« Des glandes surrénales de chiens ont été finement broyées et aussitôt divisées en deux lots : l’un servit à un dosage immédiat sur le tissu frais, l’autre a été utilisé pour un dosage après un séjour de 24 heures dans le vide phosphorique. Dans les deux cas les extractions ont été faites, d’une part par l’acide trichloracétique selon la technique de l’un de nous, d’autre part au moyen de l’acide sulfurique selon les indications de ©. Bailly et, dans chaque liqueur trichloracétique ou sulfurique d’extraction, on a dosé colorimétriquement l’adrénaline, à la fois par le procédé à l’iode et par la technique au bichlorure de mercure (*).

(*) Pour les dosages au sublimé, les extraits préparés à l'acide trichloracétique ont été préalablement neutralisés par l’ammoniaque et addi-

Cons

Les résultats, pour deux expériences différentes (I et IL), sont donnés dans ce tableau (adrénaline en mgr.) :

Dosage après action

Dosage immédiat du vide CRT ge NE Enr RE Dosage I Il T IT Extraction par : æ de ; : an Aloe ME G 20255 1,628 1,342 L’acide trichloracét e Eu 2 è : 1 ITU au sublimé. 1,535 1,308 1,604 1,358 L’acide sulfurique .. | à L iode Le 1,342 0,975 186057415518 au sublimé. 1,300 0,994 1,666 1,325. »

Ces résultats obtenus par Léon Binet et G. Weller nous paraîssent suffisamment nets pour mettre en doute l’excellence de l'extraction de l’adrénaline par l’acide sulfurique dans les glandes fraîches.

b) Dosage proprement dit : 1° La réaction donnée par le sublimé avec l’adrénaline est influencée par la réaction du milieu comme les autres réactions colorées de ladrénaline : elle n’apparaît qu'entre certaines limites de pH, et ces limites sont assez étroites, de sorte que le pH nécessaire pour la production de la coloration par le sublimé est très proche du pH auquel se produit l’oxydation spontanée de ladrénaline. Il s’en suit que lorsqu'on opère le dosage, si le pH minimum est légèrement dépassé, il se produit une oxydation spontanée de l’adrénaline qui peut-être entraîne une modification dans la nature ou l'intensité de la réaction avec le sublime.

A cause de cela, la méthode au sublimé est assez délicate à réaliser, et peut-être sujette à erreur.

2° La coloration de l’adrénaline avec le sublimé atteint son maximum 3 minutes environ après l'addition de sublimé. Il en est de même avec l’extrait de poudre de surrénales. Mais lorsque la réaction est effectuée sur l’extrait sulfurique des surrénales fraîches, la coloration apparaît beaucoup plus lentement puisqu'elle atteindrait

tionnés d’acide sulfurique. Pour les dosages à l’iode, les extraits préparés à l’acide sulfurique ont été additionnés préalablement d’acide trichloracétique.

rie

son maximum d'intensité en 25 minutes. C’est à cause de ce fait que A. Leulier prescrit de ne mettre en train la réaction de la solution témoin que 20 minutes après avoir opéré celle de la solution extractive.

Un tel retard dans la production de la coloration ne peut s’expliquer que par la présence dans l’extrait de substances autres que l’adrénaline qui opposent une gêne à la réaction. Dès lors, comment est-on assuré qu’il en résulte seulement un retard dans lapparition de la coloration et non pas un affaiblissement de cette réaction ? Il nous semble qu’il reste là un point à éclaircir.

Ces diverses critiques que nous venons d'émettre nous font croire que cette méthode de dosage ne peut, avec sa technique actuelle, être appliquée en toute sécurité aux capsules surrénales fraîches, qu’il serait utile de l’étudier plus à fond pour obtenir les garanties nécessaires à sa bonne marche.

Méthode de J. H. Barker, C. J. Eastlands et N. Evers.

En 1910, A. J. Ewins [15] a fait connaître une nouvelle réaction colorée de l’adrénaline. On l’obtient en faisant agir une solution de persulfate de potassium sur la solution d’adrénaline ; il se produit une coloration rose. La sensibilité de la réaction est, d’après l’auteur, de 1 pour 5.000.000.

À. J. Ewins indiquait que la réaction pouvait être appliquée à des extraits acides de glandes surrénales, mais sans cependant décrire aucune méthode de dosage.

En 1932, J. H. Barker, C. J. Eastlands et N. Evers [7] ont repris la réaction de A. J. Ewins et publié une méthode de dosage de l’adrénaline utilisant cette réaction.

Ces auteurs ont étudié l'influence des chlorures, du calcium, du cuivre, de la température, sur la réaction. Ils ont découvert que le pH a une importance de premier ordre, que la coloration se produit avec une rapidité et une intensité qui dépendent de sa valeur. Ils ont établi des courbes montrant que le pH optimum est 5,5. Mais le pH

s’accroit à mesure que la réaction se produit. Pour l’éviter il suffit d’opérer en présence d’un « tampon ». On le réalise facilement en utilisant comme réactif colorant une solution à 2 pour 1.000 de persulfate de potassium, renfermant également du phosphate monosodique et du phosphate disodique.

Pour le dosage de l’adrénaline dans les glandes surrénales, J. H. Barker et ses collaborateurs recommandent la technique suivante :

Faire l’extraction par l’acide trichloracétique, ajuster le pH de Pextrait à 5,4 (indicateur externe : rouge de méthyle). Ajouter un volume égal de réactif au persulfate, laisser le mélange 30 minutes à 22° et comparer au teintomètre ou au colorimètre à une solution standard d’adrénaline traitée de la même façon.

Nous avons essayé l’emploi de cette méthode pour le dosage de l’adrénaline dans les capsules surrénales de chien. Nous faisions l’extraction par l’acide trichloracétique à 10 %, en suivant la technique indiquée par G. Weller pour le dosage par lPiode.

Pour l’ajustement du pH, J. H. Barker, C. J. Eastlands et N. Evers ne donnent aucune précision sur le réactif à employer. Nous avons choisi du phosphate trisodique en solution concentrée craignant que la soude n’agisse trop brutalement.

Comme solution standard, nous avons employé une solution d’adrénaline à 0,10 p. 1.000 dans l'acide trichloracétique à 10 %, que nous amenions au pH 5,4 dans les mêmes conditions que l'extrait à titrer.

Après avoir ajouté aux deux solutions un volume égal de réactif au persulfate, nous les laissions pendant 20 à 30 minutes à l’étuve à 37°. Nous avons constaté que, comme J. H. Barker et ses collaborateurs l’ont remarqué, à 37° la coloration est légèrement plus forte et beaucoup plus rapidement atteinte qu’à une température plus basse, et qu’elle est stable plus longtemps.

Nous faisions ensuite la comparaison au colorimètre.

Sur un même extrait, nous avons toujours effectué com-

LASER

parativement au moins deux dosages, l’un par liode, l’autre par le persulfate. Aussi nous avons pu nous rendre compte rapidement de la discordance des résultats. Les chiffres obtenus par la méthode au persulfate étaient tantôt inférieurs, tantôt supérieurs aux chiffres correspondants de la méthode à l’iode ; lPécart était souvent considérable.

Nous avons pensé que cela pouvait être dû à la composition de l’extrait de surrénales dont certaines substances auraient pu modifier la coloration donnée par l’adrénaline. Pour éliminer cette cause d’erreur, nous avons appliqué à cette méthode la technique colorimétrique de G. Weller consistant à mesurer deux volumes égaux d’extrait, à ajouter à l’un d’eux une quantité connue de solution standard, à l’autre un égal volume d’acide trichloracétique à 10 %. Après avoir amené au pH 5,4 les deux solutions ainsi préparées, nous ajoutions le réactif colorant. Du rapport des intensités des colorations, nous déduisions la richesse de l’extrait en adrénaline.

Voici les résultats obtenus par ces différents procédés :

Persulfate de K nn

Technique Technique

Jode de Barker de Weller CRTOTAL ER RES ATEN PONTS PES 1,716 T'A1T 207 CATENN LITE CR ER A 1,769 1,863 0,448 L ( 1,857 2,067 Chienel I EPS Pere 2,053 1,802 l 1,852 1,807 ; 3,179 Chien AVR ENRMUNEREERrCI 4,908 — 3 104

On voit nettement par ces chiffres que les résultats de la technique de G. Weller ne sont pas plus satisfaisants que ceux de la technique de J. H. Barker.

Nous n’avons pas toutefois voulu nous en tenir à ces seuls essais, car si l’on juge une méthode comparativement à une autre, l’erreur peut être parfois du côté où on ne l’a pas prévue. C’est pourquoi nous avons pratiqué des dosages sur des tissus autres que des glandes surrénales, aux-

one

quels nous ajoutions, après broyage, des quantités connues d’adrénaline pure (3 mgr.). Nous avons ainsi opéré avec du muscle de lapin et nous avons fait un extrait trichloracétique du volume de 125 cm°. Nous avons fait une expérience semblable avec du pancréas de chien. Nous avons obtenu les résultats suivants (mgr. d’adrénaline) :

Persulfate de K

Technique Technique

Iode de Barker de Weller : 2,876 2,56 3,25 Musclesdeflapin "ester 3.006 256 3/39 Pancréas de chien......... 5118 2,817 212

Dans les dosages à l’iode, les erreurs vont de 0 à 43 %, tandis que, dans les dosages par le persulfate, elles varient de 6,1 à 29,3 %, ce qui montre bien que cette dernière méthode donne des résultats peu satisfaisants.

Dans tous les dosages précédents, les teintes obtenues avec le persulfate étaient toujours très faibles, comparativement beaucoup plus faibles que les colorations produites dans les dosages correspondants par l’iode.

J. H. Barker dit, en effet, que le dosage n’est pas possible lorsque la concentration de l’adrénaline est inférieure à 1/100.000. Or, dans les conditions où nous opérions pour les surrénales de chien, bien souvent la concentration finale n’atteignait pas ce chiffre. Nous ne croyons pas que l’on puisse extraire l’adrénaline avec un volume plus faible d’acide trichloracétique, car l'extraction risquerait d’être incomplète, On sait en outre qu’il faut ajouter à l’extrait un volume égal de réactif, ce qui a pour résultat de doubler la dilution de la solution à titrer.

Nous avons trouvé un autre défaut à la méthode, c’est que les colorations obtenues dans les solutions à comparer se prêtent généralement mal à l’examen au colorimètre, en ce sens qu’il est impossible d’obtenir l'identité des teintes, l’une apparaissant toujours d’un rose un peu grisâtre et l’autre d’un beau rose. Ceci se produit aussi bien par la technique de G. Weller que par celle de J. H. Bar-

ker, et la teinte grisâtre apparaît tantôt dans la solution standard et tantôt dans la solution extractive. Comme le réctif, la température, la durée du contact sont toujours les mêmes dans les deux solutions, nous avons pensé qu’il fallait attribuer cette différence des teintes à des différences dans le pH. Nous nous servions cependant toujours du même indicateur, le rouge de méthyle, et nous arrêtions l’addition de solution alcaline au même virage. Mais un écart minime des pH est sans doute suffisant pour causer une différence de coloration.

Quelle que soit la cause de ce fait, il en résulte que la comparaison est extrêmement difficile et doit être faite approximativement. Il y a donc là une cause d’erreur qui nous paraît peu facile à éviter et rend le dosage délicat à réaliser.

En raison des mauvais résultats obtenus, nous avons préféré renoncer complètement à utiliser cette méthode pour les dosages d’adrénaline dans les glandes surrénales de chien. Néanmoins, il nous a paru intéressant de rechercher si elle était plus satisfaisante lorsque l’on a affaire à des tissus plus riches en adrénaline. Nous avons pour cela effectué des essais assez semblables aux précédents, mais pour une même quantité d’adrénaline (3 mgr.) nous avons pris un poids plus faible de tissu et nous avons fait l'extraction avec 50 cm3 d’acide trichloracétique à 10 %, au lieu de 125 cm3. Les dosages ont donné les résultats suivants :

Persulfate de K \ 2

Technique Technique

lode de Barker de Weller Rancréas de Chien TE — 3,04 1,87 Muscle de chien ...... EVE 3,09 2,82 3,14

Ici encore l’identité des teintes n’a pu être réalisée ; cependant les résultats de la méthode au persulfate de potassium sont beaucoup plus satisfaisants (à l'exception du chiffre 1,87).

Nous en déduisons que la méthode de dosage de l’adré-

SE tee ue

naline publiée par J. H. Barker, C. J. Eastlands et N. Evers donne de bons résultats avec les tissus suffisamment riches en adrénaline (surrénales de bœuf, de cheval), mais qu’elle se révèle insuffisante pour les glandes surrénales de chien.

CONCLUSION

Parmi les méthodes de dosage de l’adrénaline dans les glandes surrénales publiées jusqu’à ce jour, beaucoup sont imparfaites, soit parce que l’extraction de l’adrénaine est incomplète, soit parce que la réaction colorée utilisée pour le dosage colorimétrique n’est pas suffisamment spécifique.

Nous avons étudié plus particulièrement les méthodes basées sur les réactions au bichlorure de mercure, au persulfate de potassium et à l’iode

Les méthodes au sublimé ne semblent pas réaliser une extraction totale de l’adrénaline contenue dans les glandes surrénales fraîches.

La méthode au persulfate de K utilise une réaction colorée qui n’est pas assez intense pour être appliquée aux glandes surrénales de chien.

La méthode à l’iode nous a paru excellente lorsqu'elle est pratiquée suivant la technique de G. Weller : l’extraction est complète, la réaction est assez sensible et spécifique pour donner de très bons résultats avec les capsules surrénales fraiches du chien.

C’est la méthode que nous avons adoptée pour ce travail.