La méthode des cultures pures
Les méthodes de recherches relatives au développement des Thallophytes devaient changer complètement avec les découvertes de Pasteur.
A partir de 1865, on savait déjà, grâce à l’illustre savant, que la stérilisation des milieux de culture
Fig. 92. — Synthèse d’un Lichen obtenue en culture pure par l’association d’une algue et d’un champignon(réduit3 foisl [d’après G. Bonnier].
LA MÉTHODE DES CULTURES PURES
était indispensable pour donner la sécurité dans l’étude d’un organisme inférieur.
Une culture pure , comme on dit, est nécessaire pour étudier d’une manière certaine, le développement isolé d’une plante thallophyte quelconque.
En même temps, Pasteur révélait tout un monde nouveau d’organismes, dont plusieurs avaient été décrits, il est vrai, avant lui; mais dont l’importance, dans la nature, dans les fermentations, dans les maladies contagieuses, n’apparut qu’à la suite des recherches de Pasteur.
On a adopté assez malheureusement le mot de «microbe » pour désigner les organismes en question, car sous ce nom sont compris des Champignons ou des Algues parfaitement classables dans les genres ou les groupes connus. Le groupe nouveau, celui qui est le plus, remarquable, au point de vue morphologique, c’est le groupe des Bactéries.
Les Bactéries sont, comme on sait, constituées par des cellules beaucoup plus petites en général que celles qui forment les autres êtres, remarquables encore par l’absence d’un noyau comparable à celui des autres cellules, par leurs spores qui se produisent intérieurement, avec formation d’une nouvelle membrane et en laissant dans la cellule, à côté de la spore, une partie non employée du protoplasma de la cellule sporifère.
Les procédés de culture pure, inaugurés par les travaux de Pasteur, n’étaient pas appliqués par lui à l’étude morphologique des organismes.
Des modifications importantes y furent apportées par les naturalistes qui se proposaient de suivre avec cette méthode rigoureuse l’évolution des Thallophytes.
l’étude des cryptogames
Van Tieghem et Le Monnier imaginèrent de petits récipients en verre qu'on pouvait stériliser préalablement, et dans lesquels quelques spores étaient placées et mises à germer dans une goutte d’un liquide approprié; et ce liquide était lui-mêine privé de germes. Le développement de l’organisme pouvait ensuite être suivi au microscope à travers la lamelle recouvrant ce petit appareil très simple.
Ces auteurs purent ainsi reprendre avec une grande précision l’étude des Mucorinées. Van Tieghem continua ensuite des recherches sur le même groupe, et appliqua cette méthode à la connaissance approfondie de champignons appartenant aux familles les plus diverses. La méthode générale des cultures en milieu stérilisé permit à Van Tieghem de réaliser des cultures tout autres et d'un grand intérêt. Traitant les grains de pollen comme des spores de Champignons, il fit voir que leur germination et leur développement peuvent être obtenus sur de la gélose, des sucres ou diverses substances organiques propres au développement des Champignons. Les filaments (ou tubes polliniques) se produisaient et se développaient sans que la présence du stigmate d’un pistil placé à leur voisinage fût nécessaire.
C’était prouver expérimentalement l’analogie entre un grain de pollen, pris dans l’étamine d’une fleur, et une spore, telle qu’une spore de champignon.
La méthode des cultures fut employée aussi avec succès par le mycologue allemand Brefeld, qui fit des découvertes sur le polymorphisme déterminé de beaucoup d'espèces de Champignons, et qui le premier put suivre, depuis la germination de la spore jusqu’à la production de nouvelles spores, le
LA MÉTHODE DES CULTURES PURES
développement complet d’un champignon ordinaire, à chapeau garni de lames ( Coprinus ).
Les procédés de culture pure furent ensuite perfectionnés, surtout par Koch en Allemagne, et on arriva à cultiver les Champignons dans un espace privé de germes, sur des milieux solides tels que des fragments stérilisés de carotle ou de pomme de terre. Lès lors, cette technique se perfectionna de plus en plus, et l’on put obtenir des cultures pures de presque tous les organismes, même celles plus difficiles des Algues, ou encore des plantes supérieures.
Ce sont ces méthodes qui seules ont permis d’entreprendre des investigations sur ce monde nouveau des Bactéries, lequel se présente actuellement comme les Cryptogames au xvme siècle, comme les Phanérogames au xvie siècle, c’està-dire apparaît comme un chaos d’organismes dont la classification est aujourd’hui à peine ébauchée. Le perfectionnement des procédés de culture, l’invention de nouveaux microscopes qui permettant d’apprécier le millionième de millimètre contribuera sans doute à élucider l’évolution et le classement de ces êtres microscopiques; mais, à cet égard, il faut avouer que presque tout est encore à faire.
Déjà, cependant, quelques-unes de ces Bactéries avaient fait l’objet de travaux approfondis; leur évolution, leurs changements de forme, la production de leurs spores, leur germination, leurs fonctions physiologiques ont été étudiés avec le plus grand détail. J’en citerai seulement quelques exemples.
En 1878 et 1879, Yan Tieghem entreprit de belles
l’étude des cryptogames
recherches sur YAmylobacter. Cette Bactérie n’est autre que ce que Pasteur appelait le « ferment butyrique». Elle est, comme on dit, anaérobie , c’està-dire vivant à l’abri de Pair dans les milieux dépourvus d’oxygène. Au lieu de respirer, cet organisme fermente, c’est-à-dire entretient son énergie aux dépens des substances dans lesquelles il se développe. Le résultat de cette fermentation est la production d’acide butyrique qui se décompose ensuite; en définitive, il se forme de l’eau, et il se dégage de l’hydrogène et du gaz carbonique.
En dehors de l’intérêt que présente ce microorganisme comme type bien net d’être anaérobie, l’Amylobacter est encore très important à considérerpar sonrôle dans laNature. C’esten effet l’agent principal de la décomposition des débris de végétaux qui s’enfouissent dans l’eau ou dans le sol, à l’abri de l’air. Un grand nombre de substances, et en particulier la cellulose, c’est-à-dire la substance des membranes des cellules, sont détruites par l’Amylobacter. Les matières organiques les plus compliquées sont ainsi ramenées à des corps relativement très simples sous faction des Bactéries.
On peut se rendre compte bien facilement de l’énergie destructive de l’Amylobacter; il suffit de mettre un certain nombre de haricots, par exemple, au fond d’un verre d’eau. Au bout de deux jours, l’eau du verre, qui ne contient plus d’oxygène, est remplie d’Amylobacters. A la fin, il ne reste presque plus rien des grains de haricot. La presque totalité de leur substance a été détruite par l’Amylobacter; tout a été transformé en eau, en gaz carbonique et en hydrogène.
Si on examine au microscope une goutte de l’eau de ce verre, on y reconnaît d’innombrables petits
LA MÉTHODE DES CULTURES PURES
bâtonnets, parfois renflés en massue, et dont beaucoup colorent en bleu violet leurs parois si on les traite par l’iode. Van Tieghem a montré que la spore germant (1, 2, 3, 4, 5, fig. 93) forme un filament qui se cloisonne et dont la cellule la plus jeune est à l’extrémité. Cette cellule jeune est mobile par elle-même et entraîne derrière elle la file de cellules plus âgées, comme une locomotive qui entraîne des wagons (6, fig. 93). Par bipartition , une nouvelle cellule plus jeune et mobile remplace la cellule terminale, et la cellule la plus âgée de la file se détache; ainsi se reconstitue le train microscopique avec le même nombre de wagons et une nouvelle machine motrice. A leur âge moyen, les cellules de l’Amylobacter transforment en amidon une partie de leur membrane cellulosique; c’est alors que, traitées par l’iode, ces membranes bleuissent. A un âge plus avancé, la cellule se renfle, une partie de son protoplasma se condense pour former une spore qui s’entoure d’une membrane nouvelle à l’intérieur de la cellule (7, fig. 93); celle-ci disparaît avec sa membrane et le reste du protoplasma non employé; la spore est mise en liberté. Les spores ainsi produites peuvent résister au contact de l’air, à la sécheresse, au froid, et à une température de plus de 100°.
Fig. 93 à 100. — Développement d'une Bactérie ( Amylobacler ) : 1, 2, 3, 4, 5. germination de la spore ; 6, individu pluricellulaire : la cellule postérieure se détache, la cellule antérieure va se diviser: 7, cellules isolées formant des spores à l’intérieur (grossi 1000 fois).
l’étude bes cryptogames
Au moment où Van Tieghem faisait ces études, le paléontologiste Renault lui montra un certain nombre de coupes pratiquées à la meule dans des fossiles silicifiés de l’époque pri maire. Dans ces préparations, Van Tieghem reconnut, admirablement conservées par la fossilisation, des Bactéries tout à fait semblables à l’Amylobacter.
C’était là une découverte capitale, montrant que le procédé de destruction des tissus végétaux, et vraisemblablement tous les phénomènes de la vie à cette époque si ancienne de l’histoire du globe, se faisait identiquement de la même manière qu’actuellement.
Quant Renault apprit que Van Tieghem avait trouvé l’Amylobacter dans ses préparations, il crut à une aberration. Il se dit que Van Tieghem venait de regarder tellement d’Amylobacters au microscope qu'il croyait en voir partout. Renault ne pensait pas à ce moment que, plusieurs années après, lui-même, plus que converti, découvrirait dans les dépôts houillers de très nombreuses espèces appartenant aux Bactéries.
Autre exemple : Matruchot et Molliard ont fait, en 1901 et 1902, une étude très complète d’une Algue verte inférieure, unicellulaire appelée Stichococcus bacillaris et qui vit normalement dans l’air humide, sur l’écorce des arbres.
Or, cet organisme si simple en apparence, si semblable à lui-même dans les conditions ordinaires de son existence, présente toute une gamme de variations lorsqu’on le cultive dans des condition diverses.
Sur de l’amidon, cette algue devient bleuâtre, sur le glucose elle prend une teinte jaune, sur la
LA MÉTHODE DES CULTURES PURES
peptone elle acquiert une teinte olivecaractéristique. Ces auteurs ont fait voir aussi que. suivant les milieux de culture, le Stichococcus acquiert des formes parallélipipédiques, cylindriques, arrondies, ovales, bifurquées, divisées, et que sa constitution interne ou la forme de son noyau subissent de profonds changements.
En fait, ces diverses formes issues d’un même individu initial, présentent souvent plus de différences entre elles que n’en olTrent deux espèces de Stichococcus observées dans la nature.
Ces exemples suffisent pour faire comprendre que l’étude d’une seule espèce, soit d’Algue ou de Champignon inférieur, soit de Bactérie, exige de nombreuses cultures pures, des expériences variées, et toute une série de recherches.
A ces difficultés viennent s’ajouter la petitesse de certains de ces organismes dont un grand nombre, comme on le sait maintenant, ne sont môme pas visibles sous l’objectif des microscopes les plus puissants.
D’ailleurs ce n’est pas seulement l’étude des Thallophytes les plus simples et les plus petits qui donne lieu à des problèmes nouveaux.
C’est ainsi que la sexualité n’est pas encore mise en évidence d’une façon nette chez les groupes les plus importants des Champignons, ceux qui comprennent toutes les grandes espèces : les Basidiomycètes, tels queleChampignondecouche, l’Oronge, le Mousseron, le Cèpe, etc., ou encore dans le groupe des Ascomycètes, qui comprend: la Morille, la Truffe, l’Helvelle, etc.
A propos de ce dernier groupe, les uns, avec Ilarper, voient la sexualité dans la conjugaison de
l’étude des cryptogames
deux filaments précédant la formation de l’appareil sporifère; les autres, avec Dangeard, nomment fécondation la conjugaison de deux noyaux contenus dans une même cellule, précédant la formation d’un sporange. Mais tout cela n’est pas clair.
Un autre problème complexe et qui donne lieu actuellement à des recherches importantes, est celui des mycorhizes et, en général, de la symbiose ou vie en commun de Champignons filamenteux microscopiques avec des plantes plus élevées en
organisation. Les Champignons désignés sous le nom de mycorhizes s’installent dans les tissus des racines ou parfois d’autres organes souterrains ; ils ne fructifient presque jamais et sont à peu près indéterminables. Frank les croyait nécessaires à la vie de toutes les Phanérogames. Gallaud a montré récemment que cette opinion est plus qu’exagérée.
Toutefois, dans certains cas, le développement d’une plante supérieure est impossible sans son
embryon qui est en partie en- 8-SSOClSltlOn COnStcLIltB 3/V6C
vahi par les filaments/ du cham- un Champignon filamenpignon (grossi 100 fois) [d’après . f , ,
Noël Bernard]. teux. C est ce qu a prouvé
Noël Bernard dans ses belles recherches sur les Orchidées. Cet auteur a montré par des expériences précises et des cultures
Fig. 101. — Début de la germination d’une graine d’Orchidée, en symbiose avec un champignon filamenteux : tg, enveloppe de la graine ; pe, cl, ps, tissu du jeune
LA MÉTHODE DES CULTURES PURES
pures qu’aucune Orchidée ne peut se développer que si elle est associée à un champignon filamenteux microscopique. Aussi bien les superbes Orchidées cultivées dans les serres que nos modestes Orchidées indigènes exigent, pour évoluer, la présence de ce champignon dans leurs organes souterrains. Dès le début de la germination de la graine, l’envahissement des tissus par cette mycorhize (fig. 101) est nécessaire pour que la graine se développe.
Je pourrais citer encore bien des questions qui se posent; mais ce que je viens de dire suffit à montrer quel vaste champ d’investigations se trouve actuellement ouvert aux chercheurs dans l’étude des plantes cryptogames.
Un fossé infranchissable, analogue à celui qui, parmi les animaux, séparait les Vertébrés des Invertébrés, semblait séparer les Phanérogames ou plantes à fleurs des Cryptogames ou plantes sans fleurs.
D’autre part, le Monde végétal, considéré dans son évolution totale à la surface du globe, pendant les périodes géologiques successives, depuis les dépôts les plus anciens où se rencontrent des fossiles, jusqu’à ceux qui correspondent aux terrains succédant à l’époque primaire, faisait voir le grand développement des Plantes sans fleurs : on a dit que l’époque primaire était le règne des Cryptogames.
Au contraire, les terrains moins anciens et jusqu’à ceux de l'époque actuelle, présentent des fossiles végétaux qui se rapportent pour la plupart à des Plantes à fleurs : on a dit qu’à l’ensemble des périodes se succédant depuis le Crétacé jusqu’à
l'époque actuelle, correspond le règne des Phanérogames.
Nous avons vu que, dès 1849, le génie de Hofmeister avait déjà diminué en grande partie la profondeur du fossé qui séparait les Cryptogames des Plantes à Heurs; les découvertes toutes récentes faites à la fois sur les plantes vivantes et sur les végétaux fossiles sont venues le combler, on peut dire, complètement.
Je parlerai d’abord des plantes vivantes. La question est un peu compliquée. Pour la rendre plus claire, je vais rappeler d’abord les principales différences signalées entre les deux grands groupes du règne végétal.
En quoi les Plantes à fleurs diffèrent-elles des Cryptogames? Ce ne sont pas, bien entendu, les organes colorés et brillants de la fleur, c’est-à-dire la corolle ou le calice, qui caractérisent les premières; car beaucoup de fleurs n’ont ni pétales ni sépales. Les caractéristiques des fleurs, nous l’avons vu, sont l’étamine et l’ovule. La parlie essentielle de l’étamine est le tissu spécial qui forme ce qu’on appelle un sac polliniqve dans lequel se différencient quatre par quatre, et s’isolent les unes des autres, des cellules destinées à devenir libres et à être rejetées au dehors. Ces cellules sont les grains de pollen. La partie essentielle de l’ovule est le nucelle, tissu dans lequel se produisent une ou plusieurs cellules spéciales ( oosphères ), restant fixes, et où se formera l’œuf, point de départ d’une plante nouvelle ou plantule.
Rappelons ce que nous avons observé. Le grain de pollen, mis en liberté par l’étamine, germe, comme on sait, soit sur la feuille modifiée ou
carpelle qui porte l’ovule, soit directement sur l’ovule. Ce grain de pollen (cellule devenue libre), lorsqu’il germe ainsi en parasite sur la plante elle-même, produit un filament plus ou moins allongé, parfois rameux, analogue à celui d’un Champignon qui attaque une plante supérieure. Ce filament, qui se nourrit aux dépens des tissus du carpelle ou de l’ovule, a reçu le nom de tube pollinique , et son extrémité vient s’appliquer sur une oosphère contenue dans le nucelle de l’ovule. C’est alors que se produit l’œuf chez les Plantes à fleurs.
L’œuf se développe aussitôt et forme la jeune plantule ou embryon; l’ensemble de l’embryon (nouvelle plante), et des tissus appartenant à la plante mère (ancienne plante), qui lui servent d’enveloppe, forme la graine; celle-ci se détache à un certain moment, lorsqu’elle est mûre, et passe à l’état de vie ralentie, presque à l’état de vie latente, suivant l’expression de Claude Bernard, et peut aller germer, c’est-à-dire, continuer son développement à distance dans le temps et dans l’espace. Ainsi, la graine, entraînée par les circonstances extérieures loin du végétal qui l’a produite et conservant son pouvoir germinatif, attend pendant un temps plus ou moins long, de se trouver dans les circonstances favorables de température, d’aération et d'humidité pour permettre à la plantule qu’elle renferme de passer de nouveau à l’état de vie active; l’embryon se développe alors en une plante tout entière, semblable à celle sur laquelle l’œuf s’est formé; cette plante donnera ultérieurement naissance à des étamines et à des ovules; de nouveaux œufs se reformeront, et ainsi de suite.
En somme, les Phanérogames seraient parlicu-
lièrement caractérisés par ces deux faits principaux :
1° Le grain de pollen germe en parasite au voisinage des tissus renfermant l’oosphère, sur la plante même qui l’a formé ou sur une plante de même espèce; autrement dit, il y a un tube polliniqne, qui va directement au contact de l’oosphère contenu dans l’ovule pour former l’œuf, point de départ de la plante nouvelle ;
2° Cette plante forme l’embryon, qui s’arrête à un certain moment dans son évolution et passe à l’état de vie très ralentie, ainsi que la partie de la plante mère qui l’entoure et le protège; autrement dit, il y a une yraine , qui pourra germer au loin et de laquelle sortira la plantule, ayant repris sa vie active et son développement.
Considérons maintenant une Cryptogame d’une organisation supérieure, par exemple une Sélaginelle, l’une de ces Lycopodiacées qu’on cultive très souvent en bordures dans les serres ou dont on trouve d’élégantes petites espèces dans la région alpine (fig. 102;.
Au sommet d'une tige de Sélaginelle, on voit au premier abord que les feuilles, serrées les unes contre les autres, ont une couleur différente de celle des feuilles ordinaires; l’aspect général de ces sommités de rameaux ressemble un peu à celui d’une fleur de Pin, et cependant la Sélaginelle n'est
Fig. 102. — Sélaginelle, plante entière , montrant tiges, racines, feuilles et rameaux sporifères (grossi 2 fois).
pas une plante à fleurs. Examinons de plus près ces feuilles spéciales; nous nous apercevrons alors que chacune d'elles porte, vers sa base, un sac coloré en jaune. Si l’on étudie ce qui se passe dans l’un de ces sacs, placés à l’aisselle des feuilles supérieures, on voit que des cellules destinées à deve-
Fi;. 103. — Coupe longitudinale schématique d’un rameau sporii'ère de Sélaginelle, montrant les microsporanges à nombreuses mierospores et les maci'O-.pora nges à quatre macrospores.
nir libres et à être rejetées au dehors s’y différencient quatre par quatre, et s’isolent les unes des autres. Nous reconnaissons là une formation identique à la production du pollen dans les étamines. El cependant cette feuille modifiée de la Sélaginelle ne s’appelle pas une étamine; ces sacs produisant des cellules devenant libres ne sont pas désignés
sous le nom de sacs polliniques, et ces grains microscopiques ne sont pas nommés grains de pollen.
On dit que les sacs portés par ces feuilles supérieures de la Sélaginelle sont des micros par anges (fig. 103), et on désigne sous le nom de microspores les cellules formant ces petits grains mis en liberté et emportés par le vent comme les grains de pollen.
Pourquoi ces noms différents pour des objets aussi parfaitement semblables?
D’abord cela tient à ce fait qu’avant Robert Brown
Fig. IO'i et 105. — Prothalle mâle île Sélaginelle, Fig. 106. — Unanthéissu de la microspore. réduit à une seule cellule rozoïde de Sélagivégétative v et à une anthéridie (non ouverte en 1 ; nelle, terminé par
ouverte en 2); p, c, parois de l'anthéridie; a, an- deux cils vihratiles
thérozoldes (grossi 50 fois). (grossi 200 fois).
et Ilofmeister, on ne s’était pas avisé de comparer ces deux productions, cà peu près identiques chez les Phanérogames et chez les Cryptogames les plus élevés en organisation; ensuite, le devenir de ces spores semble au premier abord très différent de celui des grains de pollen. En effet, les microspores ne vont pas germer en parasites sur une Sélaginelle; il n’y a pas de tube pollinique. Les microspores se développent sur le sol humide et produisent un minime prothalle réduit à une seule cellule (a, fig. 104 et 1051 et à une anthéridie. Celle-ci contient un petit nombre de cellules du milieu des-
quelles sortent des anthérozoïdes, cellules sans membrane d’enveloppe, mobiles par elles-mêmes comme des infusoires , et qui nagent dans l’eau grâce à des cils vibratiles (a, fig. 104 et 105; et fig. 106). L’un d’eux se combinant à une des oosphères, forme un œuf, point de départ d’une nouvelle plante.
Cherchons maintenant où se forment les oosphères de la Sélaginelle. Pour cela, examinons les sacs analogues aux microsporanges qui sont placés à l’aisselle des feuilles inférieures, parmi celles qui portent des sporanges. Extérieurement, ces sacs ne paraissent pas différer des microsporanges, mais au lieu de renfermer un grand nombre de petites microspores, ceux-ci ne contiennent que quatre spores relativement très grosses. On désigne ces productions sous le nom demacrosporcmc/es(i\gA03), o et l’on dit qu’au-
dessous des microsporanges contenant chacun un grand nombre de microspores, il y a des macrosporanges contenant chacun quatre macrospores (fig. 103).
Une macrospore, mise en liberté, tombe sur le sol humide et peut y germer comme une microspore, mais au lieu de donner naissance à des anthérozoïdes, elle forme un tissu (u, fig. 107) dans
Fig. 107. — Prothalle femelle de Sélaginelle, issu de la macrospore : a, a, a , archégones; v, tissu végétatif du prothalle (grossi 70 fois).
lequel sont creusées comme de petites bouteilles ( a , fig. 107); au fond de chacun de ces organes qui, comme nous le savons, sont nommés archégones, se trouve une oosphère ou cellule reproductrice femelle.
Les microspores et les macrospores sont mûres presque en même temps ; elles tombent mêlées les unes aux autres et se développent concurremment. Dès lors, il suffit que, par un temps de pluie, un des nombreux anthérozoïdes issus des microspores nageant dans l’eau rencontre le col d’un archégone issu de la macrospore, pour qu’il pénètre dans ce col de la petite bouteille, et vienne s’unir à l’oosphère. Une combinaison se forme aussitôt entre les deux cellules reproductrices, l’une fixe (l’oosphère), l’autre mobile (l’anthérozoïde), et il se. produit un œuf entouré d'une nouvelle membrane, lequel œuf se développe en plantule. Mais en ce cas, comme chez toutes les plantes cryptogames supérieures , il n’y a pas d’arrêt de développement. À aucun moment, l’embryon venant de l’œuf, ou jeune plantule, ne se détache pour passer à l’état de vie ralentie ; il n’y a pas de graine.
En somme, les Cryptogames supérieures seraient particulièrement caractérisées par ces deux faits principaux :
1° La microspore germe directement sur le sol et produit de petites cellules mobiles appelées anthérozoïdes. Un anthérozoïde peut se déplacer dans l’eau et aller s'unir à une oosphère (issue de la macrospore qui a germé sur le sol), pour donner l’œuf, point de départ de la plante nouvelle ; autrement dit, il riy a pas de tube pollinique;
2° Cette plante nouvelle se développe directement, sans passer par l’état de vie ralentie; autrement dit, il n'y a pas de graine.
Voilà donc les deux principales différences qui subsistaient entre les Cryptogames et les Phanérogames. Examinons d’abord la première, qui est de beaucoup la plus importante.
