COMPOSITION CHIMIQUE DU PIGMENT

SES RÉACTIONS MICROCHIMIQUES

Historique

La composition chimique du pigment purique à été d’abord uniquement étudiée chez les Poissons. D'une part, l'éclat métallique de ceux-ci avait très vivement excité la curiosité des chercheurs, d'autre part, comme je l’expliquerai par la suite, le pigment purique de ces animaux est beaucoup plus facile à isoler des tissus et à obtenir en quantité notable, et se prête par là beaucoup mieux à l'étude chimique que celui des Batraciens et des Reptiles.

Eurexser6 et Heinrica Rose (1833) quiles premiers analysèrent les cristaux des écailles des Poissons ne les définissent guère que comme une substance organique. SCcaniTzLEIN (1837) et Maruias (1843) en font, l’un un phosphate de Calcium, l’autre un phosphate de Magnésium, mais sans en apporter de preuves suffisantes.

Brücke reconnait le premier qu'il se trouve en présence d’une base anorganique. En faisant agir de l'acide chlorhydrique étendu sur les cristaux il croit observer un dégagement de gaz. Vox Wrrrica (1854) qui observe ce mème dégagement et qui trouve du Calcium dans les cendres admet l'existence d’une combinaison calcique.

BarreswiLL (1861) fait faire un grand pas à la question en comparant les réactions de la guanine et les réactions des cristaux. Il les trouve identiques. Vorr (1865) confirme le résultat précédent et affirme que la guanine est contenue dans les cristaux des écailles à l’état de combinaison calcique,

qu'il met en évidence par la formation d’oxalate de Calcium. Mais, étudiant ensuite les guanophores de la vessie natatoire, il n'y rencontre plus de Calcium. Künxve et Sewazz (1880) qui analysent les cristaux contenus dans l'iris de Abramis brama les trouvent formés de guanate de chaux. Ewan et Krü- KENBERG (1883) distinguent les guanophores d'aspect brillant qui contiendraient du guanate de chaux et les guanophores d'aspect mat qui contiendraient de la guanine pure. Mais CunniNenam et Mac Muxn (1883) critiquent ces résultats en disant que la présence dans la peau des Poissons de cristaux libres de sels de chaux est une cause d'erreur importante et que là où ils n'ont pas rencontré ces cristaux, comme par exemple dans la vessie natatoire, l'analyse ne leur a jamais révélé de Calcium.

En 1914, Fucus, résumant toutes les données antérieures sur les Poissons conclut à la présence certaine de guanine, presque certaine de Calcium, dans les guanophores.

C’est Levnie qui en 1868 pensa le premier à comparer le pigment irisant des Amphibiens et des Reptiles au pigment blanc des Poissons.

KRükEeNBERG et Ewazp (1882 et 1883) qui étudient en série de nombreux tissus contenant des guanophores y rencontrent de la guanine ; ils la caractérisent par deux réactions : 1° en traitant un fragment de tissu par de l'acide azotique concentré et en faisant l'épreuve de la murexide surle résidu évaporé à sec ; 2 en faisant digérer artificiellement un fragment cutané par la trypsine et en cherchant à caractériser le chlorhydrate de guanine dans le résidu non digéré. Ils recherchent en outre la présence de Calcium dans ce résidu, en faisant agir sur lui de l’acide sulfurique après calcination, mais la non formation de cristaux de gypse dans le mélange les fait conclure à l'absence de Calcium. Les résultats qu'ils obtiennent par l'étude chimique ne concordent pas toujours, sans qu'ils puissent s'expliquer pourquoi, avec une étude microscopique du tissu correspondant. Ainsi, chez Callopeltis, Lacerta, Siredon, les guanophores qu'on voit dans les téguments ne se retrouveraient plus à l’analyse chimique.

Keccer (1895) traite par un acide des peaux riches en guanophores et voit se produire un développement de gaz. ScHmipr

310 JACQUES MILLOÏ

(1917) n’observe rien de semblable chez les Reptiles. Par contre il donne des preuves nouvelles que le composé purique révélé par la réaction de la murexide est bien de la guanine en signalant sa faible solubilité dans l’'ammoniaque, la rapidité caractéristique de la formation du composé nitrique au cours de la réaction de la murexide, enfin la possibilité d'obtenir du picrate de guanine.

Il ressort de tous ces travaux, de valeur et de précision très inégales, que les guanophores des Poissons, des Batraciens et des Reptiles contiennent de la guanine. L'existence d'une combinaison calcique de la guanine parait très probable chez les Poissons ; mais chez les Batraciens et chez les Reptiles, aucun auteur n'a pu l’établir sur des preuves satisfaisantes.

J’exposerai donc ici mes recherches personnelles sur les deux points suivants : caractérisation de la guanine, absence ou présence de Calcium.

Caractérisation de la guanine

On sait que la guanine ('), C*HSN°*O ou

NH — CO — C— NH

CN | Nc née 1 nd IN CG — I

qui appartient au groupe des bases puriques, est une 2-amino- 6-oxypurine. Comme amine, elle a une fonction basique ; atome d'oxygène qu'elle contient lui donne une fonction acide. Elle se combine donc avec les acides pour former des sels et avec les bases pour former des combinaisons métalliques : avec l'acide chlorhydrique, par exemple, elle donne du chlorhydrate de guanine CH N'O.HCI + -H°0 ; avec la soude du guanate de soude CH°N'O Na°O + 6 H20.

La guanine provient de la décomposition des nucléo-protéides.

Je rappelle que les nucléo-protéides forment la masse prin-

{') Découverte par UxGer en 1845 dans le guano péruvien.

cipale des noyaux animaux et végétaux. Ils représentent, par exemple, 95 0/0 du poids total de la substance sèche dégraissée de la tête des spermatozoïdes de Hareng, 75 à 80 0/0 du poids des noyaux des lymphocytes (Lamine). La pepsine chlorhydrique les dédouble en une protéine et en un corps insoluble, la nucléine de Miescher. Cette nucléine est dédoublée par les alcalis et par la trypsine en une substance albuminoïde et en un acide nucléique qui contient tout le phosphore du noyau.

L'hydrolyse in vitro de cet acide fournit :

1° des bases puriques (adénine et guanine) ;

2 des bases pyrimidiques ;

3° des corps hydro-carbonés ;

4° de l'äcide phosphorique.

Ces dédoublements ont été schématisés par Lilienfeld dans le tableau suivant :

Nucléo-protéide

Protéine

Nucléine :

Protéine

Acide nucléique | | 3 Noyau sucré Base purique Reste phosphorique À. — Caractérisation macrochimique

Les téguments des Poissons sont les seuls dont on puisse, par des procédés mécaniques très simples, extraire en grande quantité le pigment purique. Le traitement des tissus Le plus riches en guanophores des Batraciens et des Reptiles ne fournit que difficilement une quantité de substance utilisable pour l'analyse

chimique.

Poissons. — En grattant la face externe de la paroi abdominale d’un Poisson très argenté — tel que l’Ablette — on détache de celle-ci des écailles chargées de pigment. On les broie ensuite et on Les lave à plusieurs reprises à l’eau en ayant soin de sépa-

rer par décantation le pigment, plus lourd, des débris organiques. On recueille au fond du vase une poudre brillante composée presque uniquement de cristaux et qu'on peut achever de purifier par la centrifugation. On conserve cette poudre dans de l’eau légèrement ammoniacale. Elle constitue un matériel propre à l'analyse chimique, sur lequel on recherche commodément les réactions de solubilité, de coloration et de cristallisation de la substance pigmentaire.

Tous les résultats que j'ai obtenus indiquent que, comme l'avaient vu mes prédécesseurs, le pigment irisant des Poissons est composé de guanine.

En effet :

il est insoluble dans l’eau froide, l'alcool, l'éther, le xylol, le chloroforme, la glycérine ; :

il est faiblement soluble dans l'eau node

il est très soluble dans toutes les bases, sauf dans l'ammoniaque, qui, même en excès et concentrée, dissout très mal Les cristaux. Ce caractère est un de ceux qui permettent le mieux de distinguer la guanine de la xanthine, beaucoup plus soluble dans l’ammoniaque ; ë

il est très soluble dans tous les acides, sauf dans les. acides acétique, formique, lactique, citrique ;

il est précipité de ses solutions, en présence de sels de Magnésium, par une solution ammoniacale d'azotate d'Argent, à l’état de purate argentico-magnésien ;

il est précipité d'une solution étendue par le ferri-cyanure de Potassium (en solution concentrée) sous forme de cristaux prismatiques brun jaune solubles dans l’eau chaude : réaction dite de Capranica. La xanthine n'est pas précipitée par le ferri-cyanure dans les mêmes conditions ;

il donne la réaction de la murexide. Une solution de cristaux dans l'acide nitrique est évaporée dans une petite capsule au bain-marie. On reprend le résidu sec par l'acide nitrique et on évapore à nouveau. La seule difficulté est ici de ne pas pousser trop loin ou dé ne pas arrêter trop tôt l'oxydation. On porte sur le résidu jaunâtre une goutte de lessive de soude ou de potasse : on obüent une coloration rouge. On peut remplacer la

soude ou la potasse par l’ammoniaque : la coloration est alors Jjaunâtre ;

il donne la réaction de Weiïdel : une petite quantité de poudre est mise à bouillir avec quelques centimètres cubes d’eau de chlore fraichement préparée, ou avee un mélange d'acide chlorhydrique et de chlorate de potasse. On évapore au bain-marie à sec dans une capsule que l'on place ensuite sous une cloche remplie de vapeurs d’'ammoniaque. Le résidu se colore en rouge cramoisi.

L'adénine et l'hypoxanthine ne donnent aucune de ces deux dernières réactions. La réaction de la murexide est positive avec la xanthine et avec l’acide urique, mais avec ce dernier la coloration obtenue est violette par la soude ou la potasse et rouge par l’ammoniaqué. La xanthine, avec laquelle on obtient les mêmes colorations qu'avec la guanine, peut cependant être distinguée de celle-ci par la vitesse avec laquelle se forme le composé nitrique. La xanthine, mais non l’acide urique, donne la réaction de Weidel.

Une solution de pigment dans l'acide chlorhydrique au 1/10 donne après évaporation des cristaux de chlorhydrate de guanine tout à fait caractéristiques (cf. PI. XI, fig. 2). Si la solution est suffisamment concentrée et si elle a été faite à chaud la cristallisation se produit par simple refroidissement. En ajoutant à la solution chlorhydrique une solution saturée d'acide picrique, il se forme de longues aiguilles jaunes, groupées en buissons, de picrate de guanine (PI. XI, fig. 1), auxquelles se mêlent parfois des cristaux d'acide picrique. Par une technique analogue on peut obtenir la cristallisation des autres guanates (1).

Voir a pratiqué des dosages d'azote sur les cristaux de la vessie natatoire d’Argentina sphyraenea. Les chiffres qu'il à obtenus (45,64 0/0) concordent de façon très satisfaisante avec celui que la formule de la guanine permet de calculer (46,36 0/0).

J'ai essayé de doser les corps puriques contenus dans les cris taux. J'ai employé la méthode de Hayeraft Denigès (?). La substance pigmentaire, séchée et pesée, est dissoute dans

(‘) Les cristaux de nitrate de guanine sont également très caractéristiques, PLareau en à douné une très bonne figure dans ses « Recherches sur les Aranéides Dipneumones » Mém. de l’Acad. Roy. de Belgique.

(@, Dexicès, Précis de Chimie analytique, 1923, p. 1150,

une quantité minima d’acide chlorhydrique à 1/10 (on porte à l'étuve s’il est nécessaire). On filtre et on lave en ajoutant l'eau de lavage à la solution. On complète à 100 centimètres cubes dans une fiole jaugée. On verse alors, en agitant, les 100 centimètres cubes de solution chlorhydrique dans 25 centimètres cubes de solution argentico-magnésienne N/10. On filtre et on prélève 100 centimètres cubes de filtrat correspondant à 80 centimètres cubes du liquide primitif. On ajoute à ces 100 centimètres cubes 10 centimètres cubes d’une solution N/10 de cyanure de Potassium et XX gouttes d’iodure de Potassium au 1/5. On verse goutte à goutte à l’aide d’une burette graduée de l’azotate d'Argent N/10 jusqu'à trouble persistant. On lit alors le nombre de centimètres cubes d'azotate d'Argent employés. Sachant que chaque molécule de guanine fixe deux molécules d’azotate d'Argent, on calcule facilement la quantité de corps puriques contenus dans la solution primitive ('). | |

Voici Les résultats que j'ai obtenus:

Poids de substance pigmentaire 0 gr. 57 ; poids de corps purique trouvé 0 gr. 087.

Le corps purique (guanine) forme donc un peu plus du 1/6 de la substance pigmentaire.

Batraciens et Reptiles. — Dans ces deux groupes le traitement mécanique des téguments ne permet d'extraire que des quantités inutilisables de substance pigmentaire. Le fait tient non seulement à ce que celle-ci est ici moins abondante que chez les Poissons, mais surtout à ce que les dispositions anatomiques sont peu favorables : chez les Batraciens, par exemple, les guanophores, situés dans le derme, font partie intégrante des téguments, ne se détachent qu'avec ceux-ci et ne peuvent même pas en être séparés par broyage, à cause de l'élasticité des tissus. Nous avons vu avec quelle facilité, au contraire, les écailles des Poissons se laissent réduire en poudre.

{!) J'ai employé 9 em? 5 de solution de nitrate d'Argent.

Or, le poids moléculaire de la guanine est 151. Le poids moléculaire du nitrate d'Argent est 170.170 grammes de nitrate d'Argent se combinent donc avec 73 er 8 . de guanine. sais

Par conséquent 1 centimètre cube de la solution au 1/10 contenant 0 gr. 047 de nitrate d'Argent, correspond à 0 gr, 00755 de guanine. 9 ces 3 représentent donc :

à Le û 9,3 x 0,00755 x 30 — 0'gr. 0871 de guanine,

Il m'a donc fallu renoncer à extraire mécaniquement le pigment des téguments étant donné tout au moins les moyens que J'avais à ma disposition, et j'ai dû employer des procédés chimiques. Mes recherches ont porté avant tout sur les Grenouilles communes, Rana esculenta et Rana temporaria, que l’on peut se procurer en grande quantité (il m'a fallu en effet sacrifier pour ces expériences plusieurs centaines d'animaux).

J'avais d'abord pensé à extraire la substance pigmentaire — malgré sa faible solubilité dans l’eau chaude — en traitant les peaux par l'eau bouillante. Le procédé s'est révélé insuffisant ; l'échec me parait moins dà à la solubilité trop faible du pigment qu'à la difficulté avec laquelle l’eau pénétrait jusqu’à lui : à la température à laquelle j'étais forcé d'opérer pour que la solubilité soit suffisante, les albumines des tissus coagulaient et formaient une barrière qui empêchait la pénétration du solvant. Des peaux ayant bouilli plusieurs heures et que j'avais essayé de rendre plus perméables par broyage présentaient encore à l'examen microscopique de nombreux amas de pigment presque intacts.

J'ai cherché ensuite à utiliser la solubilité du pigment dans les alcalis et en particulier à l’extraire par la soude. Voici comment j'ai opéré : après avoir pelé un certain nombre de Grenouilles, après avoir lavé leurs peaux à l’eau distillée froide, fréquemment renouvelée: afin d'éliminer autant que possible les sels solubles et le mucus, mais en ayant bien soin de ne pas prolonger l'opération au delà de quelques heures pour éviter les fermentations, j'ai traité ces peaux 12 heures par l'alcool à 95° puis 12 heures par l’alcool-éther, dissolvant ainsi les graisses (et aussi le pigment jaune). J'ai fait ensuite agir sur les peaux, préalablement séchées, de la lessive de soude au 10°, pendant un temps assez court (inoins d’un quart d'heure) pour éviter l'hydrolyse des nucléines des tissus. J'ai été arrêté en ce point par de grandes difficultés. D'une part, lorsqu'on sèche à l’étuve une peau de Grenouille, on lui fait perdre l’eau qu'elle contenait, c'est-à-dire plus des 9/10 de son poids. Lorsqu'on met ensuite cette peau séchée au contact d'un liquide (dans le cas la lessive de soude), elle tend à reprendre par imbibition son poids primitif et gonfle, de plus, sous l'action de l'aleali, De sorte que pour baigner toute la masse de substance il est néces-

saire de Jui fournir une quantité considérable de liquide ; et comme l'on doit conserver à la solution employée son titre de 1/10 afin de pouvoir extraire tout le pigment dans les délais indiqués, on est obligé de faire agir sur les tissus une quantité de soude véritablement démesurée par rapport à la faible proporüon de pigment qu'ils contiennent.

D'autre part, les téguments des Batraciens manifestent leur avidité pour l'eau non seulement en en absorbant une quantité considérable, mais en la retenant énergiquement. Ils ne restituent par compression qu'une partie de la solution sodique. La partie retenue est évidemment la plus riche en produits solubilisés.

Enfin le pigment purique n’est pas seul dissous par la soude ; c'est là un sérieux inconvénient. Diverses substances protéiques, le mucus non éliminé par le lavage, passent dans la solution. Ces corps représentent une masse beaucoup plus importante que celle du pigment dissous, si bien que le liquide obtenu est extrêmement impur au point de vue auquel je me place et qu'il est difficile d’en éliminer les substances inutiles. En effet, la coagulation par la chaleur et la purification par le noir animal entrainent par adsorption une quantité notable de pigment.

Les essais de caractérisation de la guanine que j'ai tentés sur la solution sodique ont donc été assez incertains. Ne pouvant en tirer des conclusions fermes, j'ai précisé et complété les indications qu'ils me donnaient en reprenant les techniques déjà employées par mes devanciers (Ewazp et KRUKENBrRG6).

1° Des fragments de peau sont plongés dans une capsule contenant de l'acide azotique concentré jusqu à ce que le pigment ait complètement disparu, ce que l’on contrôle au microscope. On les enlève alors. L'acide, évaporé à sec, à feu nu, laisse un résidu sur lequel on fait la réaction de la murexide.

2 Les peaux à étudier sont plongées dans l’eau bouillante puis mises en contact avec une solution très légèrement alcaline de trypsine, jusqu'à digestion complète des tissus. On isole par précipitation gélatineuse le pigment purique des autres corps qui constituent avec lui le sédiment (mélanine, formations cornées, ete.) et qui précipitent beaucoup plus lentement, ce qui rend la séparation facile, La guanine peut alors être

caractérisée par la réaction de la murexide et par la formation du chlorhydrate.

Ces méthodes donnent le plus souvent des résultats positifs. Malheureusement elles ne sont pas rigoureuses ; d'une part elles sont inconstantes et, comme je l'ai déjà dit, n'ont pas mis la guanine en Lence chez certaines espèces de Vertébrés inférieurs dans les téguments desquels le microscope révèle cependant la présence indiscutable de guanophores. D'autre part, leur brutalité peut introduire dans la solution finale des bases puriques artificielles. C’est ainsi que, comme l'a montré récemment Levene (!), l'acide azotique concentré et chaud est capable, même lorsqu'il agit peu de temps (1/4 d'heure), de faire subir aux nucléines contenues dans les tissus un commencement d'hydrolyse qui entraine une libération partielle des bases puriques.

Malgré ces causes d'erreur possibles, on est. autorisé à admettre que le pigment purique des Batraciens et des Reptiles est bien à base de guanine comme celui des Poissons. La microchimie va d’ailleurs nous montrer l'identité des réactions du pigment dans.ces trois groupes zoologiques.

B. — Caractérisation microchimique.

Les raisons pour lesquelles j'ai été obligé de distinguer précédemment entre les Poissons, d’une part, les Batraciens et les Reptiles, d'autre part, n'ayant plus d'importance lorsqu'il s'agit de l'étude de coupes et d’étalements, et les réactions étant identiques pour toutes les préparations quels que soient les animaux qui aient servi à les faire, j'exposerai iei ce qui concerne l’ensemble des Vertébrés inférieurs.

J'ai constaté microchimiquement l'insolubilité des cristaux des guanophores dans l’eau froide, l'alcool, l’éther, le chloroforme, leur solubilité plus ou moins rapide dans les solutions acides ou alcalines et dans l'alun de fer.

Parmi les acides couramment employés, ceux qui ont l'action dissolvante la plus énergique sont les acides chlorhydrique, azotique, sulfurique, oxalique.

(9) Levene. Journal of Biological Chemistry, janvier 1923,

À 16° une solution à { 0/0 d'acide chlorhydrique dissout les cristaux en quelques minutes.

À 16° une solution saturée d'acide picrique dissout les eristaux en 2 ou 3 heures.

À 16° une solution à 5 0/0 d'acide oxalique dissout les cristaux en 15 minutes.

L’acide chromique et l'acide acétique (non concentrés) ont au contraire une action très faible sur Les cristaux. Ceux-ci sortent intacts au bout d’une heure d'une solution à 10 0/0 d'acide acétique, même lorsque le liquide est porté à une température de 25°

La soude et la potasse ont sur les cristaux une action éner-

gique et très comparable. Leurs solutions au font disparaître les cristaux an instantanément ; au il suffit de quelques

minutes, au 75 go de moins d'un quart d'heure pour que les gua-

nophores dé vidés. Lorsque on augmente encore la dilution, l'action est très ralentie.

La baryte dissout facilement les cristaux.

L'ammoniaque n’agit pas en solution faible, et même, comme Je l'ai dit, l’eau ammoniacale peut être employée pour la conservation des cristaux.

La solubilité dans l’eau chaude n'a jamais été signalée. Cependant une préparation maintenue une heure dans l’eau à 40° ne présente plus trace de pigment purique. Au bout d'un quart d'heure celui-ci est déjà considérablement altéré

Par comparaison avec les expériences que j'ai faites in vivo et que J'exposerai par la suite, j'ai essayé de dissoudre le contenu des g guanophores à l’aide de solutions de pipérazine, d'Urodonal et d'Atophan. Ces corps, surtout le premier, font disparaitre rapidement les cristaux.

Les réactions macrochimiques de cristallisation de la guanine sont inapplicables sur les coupes. La trop grande taille des cristaux qu'on cherche à obtenir, d'une part, — le fait que toute opération de cristallisation demande une dissolution préalable du pigment grâce à laquelle celui-ci diffuse dans toute l'étendue de la préparation, d'autre part, — enfin la

faible quantité de pigment contenu dans une coupe ont rendu tous mes essais infructueux.

Les réactions de coloration (de la murexide et de Weiïdel) ne sont pas plus utilisables en microchimie. Elles ne me paraissent pas assez sensibles pour donner des résultats positifs en présence de petites quantités de substance purique, de plus. elles sont extrêmement brutales et ne conservent point à Ja’ coupe une structure suffisante pour que la topographie même grossière de celle-ci soit conservée.

La réaction argentique (formation d’une combinaison argentique plus ou moins colorée) peut être effectuée de différentes façons :

par la méthode de Courmont et André (!);

par la méthode au carbonate d'Argent de del Rio Hortega, que l’on peut appliquer sur des coupes, mais aussi sur des étalements minces, ainsi que l'a montré Verne (1921);

par un procédé peut-être plus simple consistant à employer une solution d'azotate d'Argent de taux variable (1 à 5 0/0) à laquelle on ajoute de l’ammoniaque jusqu'à ce que le précipité d’hydrate d'Argent qui se forme au début et qui est soluble dans un excès d’ammoniaque se soit dissous. On plonge la préparation dans ce liquide pendant un temps variable (de quelques minutes à 1/4 d’heure) suivant la nature de la préparation à colorer, et en portant ou non à l’étuve.

Par l’action de ces diverses méthodes, le pigment purique prend une coloration allant du brun au noiïrâtre. La réaction n’est malheureusement pas spécifique. On sait que les méthodes argentiques peuvent colorer des corps très divers et qu'elles ont été appliquées à la mise en évidence de phosphate de chaux par exemple (méthode de Kossa). | 3

Cherchant à caractériser microchimiquement la guanine pigmentaire par une réaction colorée, j'ai essayé d'utiliser les propriétés du noyau imidazol, et plus particulièrement des substances dans lesquelles celui-ci a conservé non substitué l'H du radical imide (xanthine, guanine) et qui donnent avec les corps diazoïques des réactions intensément colorées.

(:) Journal de Physiol. et de Pathol. générales, 1905,

J'ai cherché à faire réagir un sel de diazoïque d'abord in vitro sur la guanine, puis sur des coupes contenant du pigment purique J'ai opéré avec du chlorhydrate de diazobenzène obtenu en traitant de l’aniline par le nitrite de soude en milieu chlorhydrique :

On mélange dans un Becherglass 4 gr 65 d'aniline avec 100 centimètres cubes d'acide chlorhydrique normal (3 gr. 65). On agite jusqu'à dissolution; au cas où l’aniline ne serait pas très pure il est prudent d'en mettre un léger excès (15 cgr. par exemple). D'autre part on dissout 3 gr. 45 de nitrite de soude dans 50 centimètres cubes d’eau froide. On place le Becherglass dans un appareil réfrigérant. Lorsque la température atteint environ — #° on verse peu à peu le nitrite dans la solution chlorhydrique d’aniline en agitant constamment.

On ajoute à un centimètre cube du réactif ainsi préparé quelques gouttes d’une solution chlorhydrique de guanine, puis quelques gouttes d’une solution aqueuse de soude. Il se produit aussitôt une coloration rouge foncé intense. En remplaçant la soude par de l’ammoniaque, on obtient une coloration analogue ; en la remplaçant par de la chaux, on obtient une coloration jaunâtre.

J'ai essayé d'appliquer cette réaction directement aux tissus, en traitant des coupes riches en pigment, collées sur lame et déparaffinées, par la solution de diazoïque additionnée d’une goutte de solution étendue de soude : avec une rapidité plus ou moins grande et sans que la quantité de pigment présente paraisse influer, il se développe une coloration rouge intense qui envahit rapidement toute la préparation (on assiste en même temps à un dégagement d'azote), et qui ne permet de caractériser électivement aucun élément du tissu.

me fallait expliquer la raison de cette coloration massive des coupes. Dans ce but, j'ai traité x vitro des corps très divers par le réactif diazoïque en milieu alcalin. J'ai obtenu avec la cholestérine, la tyrosine, lhémoglobine, les solutions sodiques de protéimes des réactions colorées très comparables à celle que la guanine m'avait fournie. Il n’était pas étonnant, dans ces conditions, que les {issus traités prissent une coloration diffuse.

J'ai essayé alors de remplacer l'aniline par la xylidine dans la fabrication du diazoïque pour voir si le nouveau corps formé

se montrerait plus électif vis-à- vis de la guanine. Les résultats n'ont pas été supérieurs à ceux que j'avais d'abord obtenus. Bien que j'aie échoué dans ma tentative, la question ne me parait pas devoir être abandonnée. Peut-être pourrait-on, à partir d’autres amines (toluidine, etc.), obtenir un diazoïque donnant avec la guanine une coloration qui permette de la caractériser. Les corps théoriquement susceptibles d'être étudiés à ce point de vue étant fort nombreux, j'ai dù renoncer faute de temps à poursuivre mes recherches dans ce sens.

Recherche du calcaire

1° Poissons. — La plupart des auteurs admettent, nous l'avons vu, que la guanine existe dans le pigment irisant des Poissons sous forme d’une combinaison caleique. Pour vérifier ce fait, J'ai dosé le Caleium sur la poudre de cristaux préparée comme il a été dit plus haut, et j'ai eu la surprise d'obtenir des résultats tout à fait contradictoires avec ceux qui étaient classiquement admis. Il faut opérer de la façon suivante :

Mettre dans une capsule de platine tarée une certaine quantité de poudre de cristaux (conservée en solution ammoniacale). Après avoir évaporé lentement à sec, et porté à l’étuve à 110° pendant trois heures, peser le résidu sec, puis le calciner à feu nu. Le charbon disparait très facilement sans qu'il soit nécessaire d'employer le mélange sulfo-nitrique. Peser à nouveau pour avoir le poids de cendres. Celles ci, reprises par quelques centimètres cubes d'acide sulfurique pur dilué au quart environ, sont mises dans un verre de Bohême. La capsule est lavée avec de l’eau acidulée par l'acide sulfurique; les eaux de lavage sont ajoutées à la solution. On complète à 50 centimètres cubes. On ajoute alors 20 centimètres cubes d’une solution de chlorure d'ammonium à 20 0/0 et 5 centimètres cubes d'ammoniaque pure (en présence de phosphates et de Magnésium il se ferait un précipité ; le liquide restant clair, il ne contient donc pas de Magnésium). On verse dans le mélange de l'acide acétique cristallisable re virage du rouge de méthyle (réaction acide, P, entre 4,8 et 5,2). On porte à ébullition franche. On retire du feu et on ajoute 5 centimètres cubes d’oxalate d'Ammonium pur à 5 0/0. On couvre et on laisse reposer 24 heures.

329 JACQUES MIiLLOT

On filtre sur un filtre sans plis, on lave le précipité trois ou JL fois avec quelques centimetres cubes d’eau bouillante jusqu'à ce que les eaux de lavage ne réduisent plus le permanganate de Potassium. On rsprutit le précipité dans le verre de Bohême avec la pissette à eau bouillante après avoir percé le filtre. On lave celui-ci sans retirer Le verre avec 5 centumètres cubes environ d'acide sulfurique au 1/4 bouillant. Le liquide total est alors porté juste à l’ébullition et titré au permanganate de Potassium M7/100.

Chaque centimètre cube de permanganate employé correspond à 1 milligramme de chaux. J'ai appliqué cette méthode à quatre échantillons de poudre de cristaux de provenances différentes. Voici les résultats que j'ai obtenus :

Poids de substance

sèche Poids des cendres Calcium dosé Calcium 0/00 Ogr. 1530 0,0020 0,0015 9,80 0 gr. 1909 0,0024- 0,0020 10,025 0 gr. 1030 0,0019 0,0015 14,58 0gr. 1000 0,002% 0,0019 19,00

Les très faiblés quantités de cendres obtenues doivent à mon avis faire rejeter l'hypothèse que la guanine existe dans les cristaux à l'état de combinaison minérale. Je suis sur ce point én contradiction avec Voir qui trouve, après calcination des cristaux, des « quantités importantes de cendres fortement alcalines et donnant un abondant précipité d'oxalate de chaux ».

Les chiffres, fournis par mes expériences, exprimant la teneur en Calcium oscillent autour de 14 0/00. On remarquera leurs variations considérables selon l'échantillon examiné. Les différences, qui vont du simple au double, sont inexplicables si le Calcium trouvé provient d’une combinaison calcique de la guanine dont les proportions sont évidemment constantes. Mais si, comme je le pense, il s'agit de Calcium provenant d'impuretés, telles que débris de peau, écailles ete., dont il est impossible de se débarrasser complètement et dé les proportions varient avec chaque échantillon, les différences obtenues se comprennent d'elles-mèmes,

La présence de cristaux libres de phosphate de Calcium

signalée par Cunnienam et Mac Munx dans la peau de certains Poissons, l’existence dans les écailles non pigmentées d'une quantité de Calcium appréciable, viennent à l'appui de ma manière de voir. Si Vorr a obtenu dans ses dosages des quantités de Calcium très supérieures aux miennes, c’est sans doute parce quil à opéré sur un produit insuffisamment débarrassé de ses impuretés.

2 Batraciens et Reptiles. — Faute de matériel, j'ai dû abandonner la fecherche du Calcium chez les Reptiles et me limiter aux Batraciens (Grenouilles). Les difficultés d'extraction du pigment déjà signalées m'ontobligé à doser le Calcium dans les peaux elles-mêmes. La certitude où j'étais que le calcaire s y trouvait représenté dans d’autres éléments que les cellules à guanine m'a obligé à doser comparativement celui-ci dans des peaux très riches en pigment (peaux ventrales) et dans des peaux moins fortement chargées de ce dernier (peaux dorsales). Si je trouvais enfre ces divers échantillons des différences constantes, et suffisantes, au point de vue de leur teneur en calcaire, en faveur des fragments abdominaux, J'étais autorisé à rapporter ces différences à la présence du pigment.

Voici la technique que j'ai suivie :

5 lots de peau ventrale, 5 lots de peau dorsale sont lavés à l’eau, à l'alcool, à l’éther (voir plus haut), puis mises à sécher quelques heures à l’étuve. On les caleine à très petite flamme ; on obtient un charbon poreux. Lorsque la combustion et la crépitation se ralentissent, on augmente la flamme et on calcine fortement au rouge vif.

On fait ensuite dés attaques répétées par quelques gouttes d'acide sulfurique et d'acide azotique, en recalcinant, jusqu'à ce qu'on obtienne des cendres blanches. Sur celles-ci, on dose le Calcium par la méthode habituelle. Je ne me dissimule pas les causes’ d'erreur que comporte ce procédé :

1° J'ai déjà signalé que dans les circonstances défavorables où l’on est forcé d'opérer, c’est-à-dire en présence de tous les éléments de là peau, la quantité de Calcium trouvée doit être

en grande partie rapportée à des formations non pigmentaires (sang, mucus, et même dépôts calcaires, etc.) ;

90 Parrni les sels de Calcium contenus dans la peau et non

dans les guanophores, beaucoup sont sans doute solubles. Le

lavage, qui ne peut être rigoureusement identique pour deux

échantillons différents, les entrainera donc en quantité variable,

et la difficulté d'un dosage comparatif en sera très augmentée. Quoi qu'il en soit, voici les résultats que J'ai obtenus :

Peau abdominale Peau dorsale riche pauvre eu pigment en pigment 1 dosage. . . . 3,4 0/00 9,4 0/00 DUT ANSMRERE à 4,6 0/00 0,87 0/00 SNS MERS 8,7 0/00 6, 0/00 RAR CAR EEE 5,85 0/00 3,43 0/00 Bel NOM MAS Eee 2,39 0/00 3,900/00 .

Comme le montre le tableau ci-dessus et bien que mon dernier dosage ne concorde pas avec Les précédents, il semble qu'il y ait plus de Calcium dans les peaux abdominales que dans les peaux dorsales. Je me refuse cependant à interpréter ces chiffres, non seulement à cause du peu de rigueur que les conditions dans lesquelles on est obligé de l'appliquer donnent à une méthode par ailleurs satisfaisante, mais encore parce que je Les considère comme trop voisins de la teneur normale des peaux en Calcium et comme trop variables suivant les échantillons considérés.