II. — LES TECHNIQUES

Les premiers auteurs qui ont voulu doser les variations de l’antitrypsine dans le sérum sanguin sont Ascoli et Bezzola. Us déterminaient quelle quantité de sérum était nécessaire pour arrêter Faction digestive de la trypsine sur la gélatine. Dans une série de tubes à essais ils ajoutaient, à une quantité fixe de trypsine, des doses croissantes de sérum. Au bout de dix minutes, ils versaient, dans chaque tube, 3 centimètres cubes de gélatine à 3 p. 100 additionnés de 1 p. 100 de fluorure de sodium. Ils laissaient les tubes ainsi préparés deux heures et demie à la température de 37°. On les reportait ensuite dans la glacière. La gélatine qui n’avait pas été digérée se solidifiait; d’après la quantité de sérum capable d’empêcher la digestion de la gélatine on calculait le litre du pouvoir antitryptique. Cette technique assez complexe ne conduisait pas à des données extrêmement précises.

En 1906, Muller et Jochmann indiquèrent un procédé plus clinique au cours de leurs recherches sur le ferment protéolytique des leucocytes polynucléaires. Les leucocytes polynucléaires renferment en effet un ferment protéolytique que l’on met en liberté en détruisant les leucocytes par la chaleur à une température de 55°.

Les auteurs mettaient dans une étuve chauffée entre 50 et 55° une plaque de Pétri contenant du sérum coagulé et déposaient à la surface du sérum de petites quantités de pus contenant des leucocytes polynucléaires. Au bout de vingt-quatre heures on voyait apparaître de petits godets provenant de la digestion du sérum. Si l'on mélange à une quantité déterminée de pus des quantités croissantes de sérum sanguin, il est facile de déterminer à quel moment on observe un arrêt complet de la digestion tryptique.

Il y avait pourtant dans cette technique une cause d’erreur importante Le pus employé n avait pas toujours la même richesse en polynucléaires. Aussi, un progrès réel fut réalisé,

lorsque Marcus proposa d’employer à la place de pus une émulsion aqueuse de trypsine. Wiens, de son côté, avait employé le ferment protéolytique des leucocytes que la maison Merck a introduit dans le commerce sous le nom de leucoferment. Mais actuellement, la technique habituelle, lorsqu’on a recours au procédé de Muller et Jochmann, consiste à employer une solution de trypsine.

Pogenppohl, qui a employé ce procédé, donne les conseils sui- * vants :

« Je fais coaguler le sérum de Lœffler (3 parties de sérum de bœuf et une partie de bouillon ordinaire, glucosé à 1 p. 100) dans des boîtes de Pétri à la température de 85-90° dans un appareil spécial ou simplement au bain-marie. Un sérum bien coagulé doit présenter une surface complètement lisse et résistante, telle qu’en y promenant une anse de platine, on ne doit pas y laisser de traces.

« Le milieu préparé selon cette technique doit rester pendant trois à cinq jours à la température de laboratoire avant d être employé. De cette façon, l’eau de condensation aura le temps de se déposer sur la surface intérieure du couvercle et pourra ensuite être enlevée au moyen de papier filtre. Il faut éviter que les gouttes d’eau ne tombent sur la surface du sérum : sur une surface touchée par l’eau les gouttes du réactif ne restent pas limitées, mais se diffusent.

« Comme agent protéolytique, je me sers, ainsi que Marcus, d’une émulsion aqueuse à 1 p. 100 de trypsine de C.-A.-F. Kahlbaum. Pour obtenir une émulsion bien homogène, il est nécessaire de bien secouer le mélange. Le réactif s’altère très facilement, même étant conservé à la glacière ; après trois ou quatre jours il perd beaucoup de sa force ; aussi faut-il employer toujours une émulsion fraîchement préparée, ce qui est naturellement un inconvénient de procédé. »

Un des ennuis de cette technique est qu’il faut attendre dixhuit à vingt heures, pour lire le résultat sur la plaque de Pétri.

En dehors des inconvénients pratiques, ce retard constitue une cause d’erreur, car le pouvoir antitryptique n’est pas fixe; il va en diminuant à mesure que les heures s'écoulent et ce n’est que pendant les deux ou trois premières heures, comme l’a indiqué Bayliss, que le pouvoir antitryptique est à son maximum.

POUVOIR ANTITRYPTIQUE DU SÉRUM SANGUIN

Un procédé tout différent et qui n'exige pas une attente aussi longue pour connaître les résultats, dérive de la méthode proposée par Gross et Fulde, pour doser la trypsine. Une solution de caséine constitue un liquide limpide; l’addition d'acide acétique y détermine un précipité. Mais si on fait agir sur la solution de caséine une certaine quantité de trypsine, la caséine digérée n'est plus précipitée par 1 acide. Cette réaction permet d'arriver assez facilement à un dosage de l’antitrypsine.

Kurt-Mayer, qui a employé ce procédé, a toujours recours à une solution de trypsine dosée de telle façon que 0cm!,5 en une demi-heure à 37° digère complètement 2 centimètres cubes de la solution de caséine à 2 p. 100. Pour mesurer l’activité antitryptique du sérum, on ajoute à 2 centimètres cubes de la solution de caséine additionnée de ()cm\ 1 de sérum des doses croissantes de la solution de trypsine en commençant par 0,5. Comme le sérum a toujours une certaine action empêchante, la digestion n’est jamais complète en une demi-heure avec 0.5 de la solution de trypsine, et l'addition d’acide acétique détermine toujours un précipité. La quantité de trypsine nécessaire pour digérer dans ces conditions 2 centimètres cubes de la solution de caséine additionnée de sérum, donnera donc la mesure exacte du pouvoir antitryptique du sérum.

Ce procédé paraît des plus exacts. Mais on lui a pourtant reproché la difficulté d’apprécier d’une façon précise le moment où l'acide acétique commence à déterminer un certain trouble.

La technique que nous avons adoptée est en quelque sorte intermédiaire au procédé de Muller et Jochmann, et à celui de Fuld et Gross. Elle consiste à étudier la digestion de la caséine par un procédé plus facile, n exigeant pas la production de précipités Elle a été indiquée par Mandelbaum et nous a paru fort ingénieuse. Elle a encore un avantage, c'est que les résultats sont obtenus en une demi-heure. On prépare des plaques d’agaragar additionnée de lait. Sur une plaque ainsi préparée, si l’on dépose quelques gouttes d’une solution de trypsine, on voit apparaître un disque clair, transparent, nettement appréciable sur un fond noir. Cette apparence tient à ce que la trypsine a digéré la caséine du lait. On se rendra mieux compte de cette action en regardant ce qui se passe lorsqu on lait digérer du lait dans un tube à essai par de la trypsine. 11 prend rapidement une appa-

ARCHIVES DES MALADIES DE L’APPAREIL DIGESTIF

rence blanc sale et si l’on ajoute une certaine quantité d’éther, la graisse se dissout parce que l’émulsion a été détruite. La trypsine dissout la mince couche de caséine qui entoure chaque globule de graisse ; c’est à la digestion de la caséine qu’il convient donc d’attribuer l’aspect si spécial des plaques d’agaragar après son action.

On comprend facilement qu’en ajoutant à une même dose de trypsine des doses croissantes de sérum, il sera facile de mesurer à quel moment l’activité de la trypsine a été arrêtée. On connaîtra alors le pouvoir antitryptique du sérum.

Voici d’ailleurs des détails plus complets sur notre façon de procéder et d’apprécier l’activité antitryptique.

Technique de nos recherches personnelles.

Le matériel dont nous nous servons pour faire l’épreuve comprend : une lancette et un tube à centrifuger destiné à recueillir le sang ; les plaques de caséine, une solution de trypsine, une pipette, une plaque de porcelaine portant une douzaine de petits godets, une anse de platine et enfin une étuve.

Préparation des plaques. — On fait une solution d’agar-agar dans l’eau à 20 p. 1.000 qu’on filtre à chaud. On ajoute à cette solution une quantité égale de lait. On porte le mélange à 100° au bain-marie. Puis, après l’avoir laissé refroidir vers 60°, on le verse en couche dans des boîtes de Pétri. Autant que possible, il est bon que les couches aient une épaisseur à peu près semblable et il est préférable qu’elles soient minces car la réaction est alors plus facile à voir.

Quand les plaques sont réussies, elles sont d’un blanc laiteux, d’un aspect homogène, avec une surface lisse, comme glacée, et non humide. Si la plaque est humide, en effet, la goutte qu’on y déposera plus tard « coulera », et la réaction se fera mal ou à peine. En cas d’humidité, on fait facilement évaporer l’eau en portant la plaque quelques instants à l’étuve avant de faire l'épreuve.

Nous avons eu soin de n’employer que des plaques récemment préparées, car, malgré toutes les précautions d’asepsie que nous prenions, après plusieurs jours nos plaques poussaient, soit avant l’épreuve, soit durant le séjour à l’étuve. Or, la culture est d’un côté susceptible de fausser les résultats, et, d’un autre côté, rend la lecture de ceux-ci très difficile.

Solution de trypsine. — Cette solution dans l’eau est à 1 p 100. Nous avons toujours employé la trypsine de Grubler.

La solution doit être très fraîche, faute de quoi elle perd de sa puissance digestive. Pour nous, afin que nos résultats soient absolument

POUVOIR ANTITRYPTIQUE DU SÉRUM SANGUIN

comparables, nous avons toujours usé d'une solution préparée extemporanément.

Epreuve. — On recueille, après piqûre d’un doigt à la lancette, un centimètre cube de sang dans un tube à centrifuger. On sépare le caillot du sérum par une bonne centrifugation et on dépose, au moyen de la pipette, une goutte de ce sérum dans chaque petit godet de la plaque de porcelaine. Avec la même pipette, lavée et flambée, on ajoute alors dans chacun des godets un nombre progressivement croissant de gouttes de la solution de trypsine, de telle façon que chaque godet contienne une goutte de plus que le précédent et on mêle intimement sérum et solution. On a ainsi des mélanges de : une goutte de sérum avec une, puis deux, trois, etc., gouttes de solution de trypsine. On dépose ensuite sur les plaques, au moyen de l'anse de platine, une goutte de chaque mélange et aussi une goutte de la solution pure comme témoin. Ces gouttes ne doivent pas être trop grosses, sinon elles s’étalent et la réaction est moins nette.

On porte les plaques à l'étuve réglée vers 50° et on les laisse durant une demi-heure.

Au bout de ce temps, on procède à la lecture des résultats.

La goutte de solution pure a digéré la caséine et laissé une petite tache claire, se détachant nettement sur le fond de la plaque et bordée d'un mince liséré blanc opaque. Par transparence, la tache est plus translucide que le reste de la plaque.

Si on examine alors les endroits où on a déposé les mélanges sérum-trypsine, on voit que certains n'ont laissé aucune trace, et qu’à partir de l'un d'eux il reste une tache semblable à celle ci-dessus. On peut en conclure qu'à partir de ce mélange le pouvoir empêchant du sérum est annihilé et qu'il est égal au taux du mélange immédiatement inférieur. Si, par exemple, la goutte du mélange : une goutte de sérum avec six gouttes de solution de trypsine, a digéré la caséine, tandis que le mélange : une goutte-sérum cinq gouttes solution, n'a produit aucune digestion, on en conclut que le sérum a le pouvoir d'annihiler le pouvoir digestif de cinq fois son volume de solution trypsique, mais non de six. Ce qu’on traduit généralement en disant que ce sérum a un pouvoir antitryptique égal à 1/5.

Comme il s'agit ici d'un simple rapport, il est bien entendu qu'il faut déterminer pour chaque procédé, on pourrait quasi dire pour chaque opérateur, dans quelle limite varie le pouvoir antitryptique du sérum des individus normaux. Ce qu'il faut en effet rechercher, tout au moins actuellement, c’est non pas le pouvoir antitryptique réel, calculé d’après une unité fixe, connue, mais simplement si tel sérum a un pouvoir antitryptique égal ou supérieur à celui d’un sérum d'individu normal.

Pour nous, nous considérons, avec notre technique, comme pouvoir normal, un pouvoir antitryptique qui ne dépasse pas 1/4, et comme anormal et trop élevé tout pouvoir qui dépasse 1/4.

Nous avons déjà dit que pour donner à cette épreuve toute la

valeur qu’elle est susceptible de posséder, il faut prendre certaines précautions afin de diminuer toutes les chances d’erreur dont elle est entourée.

C'est ainsi que nous avons signalé et que nous rappelons la nécessité d’avoir une solution de trypsine fraîche, d’avoir des plaques récentes et sèches, de déposer une goutte légère, etc.

Il faut ajouter que le moment de la prise du sérum sur le sujet n’est pas indifférent. On sait en effet que le pouvoir antitryptique du sérum augmente, par exemple, durant la digestion.

Afin de nous placer dans des conditions, autant que possible toujours identiques, nous avons prélevé le sérum le matin, soit à jeun le plus souvent, soit longtemps après un petit repas extrêmement léger (un verre de lait quatre heures avant, par exemple) .