LA PRÉPARATION DU BACTÉRIOPHAGE POUR LA THÉRAPEUTIQUE

Rien n’est plus difficile dans la question du bactériophage que les techniques de sa préparation. Elles semblent simples au premier abord, mais elles sont en réalité très délicates. Elles ont donné lieu à de nombreux déboires et à de nombreux échecs entre les mains de ceux qui n’ont pas l'habitude de manier le bactériophage.

Il est relativement simple de reproduire au laboratoire le phénomène de d’Herelle, de filtrer et d'obtenir du principe lytique destiné à des expériences. Il n’y a pas de précautions spéciales à prendre. Mais, si l’on destine le bactériophage à des applications thérapeutiques, on comprend qu'il soit nécessaire de s’entourer de garanties multiples. Le but que l’on doit chercher à atteindre est la stérilité (nous ne disons pas l’ultra-stérilité). Rien de visible ne doit se développer dans ce que l’on aura à injecter au malade.

La difficulté pour atteindre ce but réside dans le fait qu'il est impossible de chauffer le principe lytique à une température élevée, on le détruirait en même temps que les germes visibles qui auraient pu l’infecter. (Au cours des premiers essais thérapeutiques, on employait pour détruire les germes visibles qui auraient pu infecter le bactériophage, un chauffage à 50° ou 550. Cette technique a été complètement abandonnée : elle réduit, en effet, considérablement le pouvoir du principe lytique). On est donc obligé de recourir à une autre technique : la filtration, Celle-ci est délicate, demande un matériel particulier et surtout une grande habitude. Bien plus, elle n’est parfois pas suffisante. En effet, presque toujours il apparaît dans les filtrats de bactériophage des cullures secondaires sur lesquelles Hauduroy a particulièrement attiré l'attention. Nous y reviendrons tout à l'heure et nous dirons comment on peut arriver à les éliminer.

Aro

Toutes les préparations de bactériophage antistaphylococcique que nous avons employées proviennent de souches conservées au laboratoire de bactériologie de la Faculté de Médecine de Paris. C’est grâce à la collaboration du docteur Hauduroy, qui nous à fourni les préparations de bactériophage, que nous avons pu appliquer ce traitement aux différentes manifestations à staphylocoques que l’on observe en oto-rhino-laryngologie, en particulier à l’otite externe furonculeuse.

Nous n'indiquerons pas dans ce travail les nombreuses techniques qui ont été décrites où employées pour isoler le bactériophage. Nous ne décrirons pas davantage les techniques de l’exaltation de la virulence du bactériophage, pas plus que les techniques d'augmentation de polyvalence ou celles de sa numération. On trouvera les descriptions de ces techniques dans les ouvrages appropriés.

Nous ne ferons qu’indiquer ici la technique qui a servi à la préparation du bactériophage que nous avons employé.

a) Les souches de bactériophages.— Il est nécessaire pour l'usage thérapeutique de se servir de souches de bactériophages à la fois très actives et très polyvalentes. On comprend, en effet, que ce soit là une des raisons du succès de l'application. Une souche très active est celle qui «in vitro» détruit rapidement le microbe qu'on met en sa présence et le détruit très complètement (macroscopiquement et microscopiquement). Si des cultures secondaires apparaissent soit avant, soit après la filtration, ce ne doit être que tardivement. La grande polyvalence est aussi nécesaire. Les variétés de microbes contre lesquels on va avoir à lutter au cours du traitement sont nombreuses. Les souches que nous avons eues à la Faculté possédaient une grande activité et une grande polyvalence. Elles avaient été isolées à partir de pus humains et exaltées par de nombreux passages sur des staphylocoques divers. Elles étaient conservées en eau peptonée, à la température du laboratoire. (Le principe lytique vit très longtemps dans ces conditions et ce n’est qu'après plusieurs années parfois qu'il a perdu son activité.)

Voici maintenant la technique qui a été indiquée par

Hauduroy et que nous avons suivie avec lui dans la préparation du bactériophage.

b) La mise en train de la préparation. — Cette préparation n'est pas autre chose que la répétition du phénomène de d'Herelle. Ces manipulations sont délicates et doivent être faites avec les plus grandes précautions de stérilité. En voici l’énumération :

1° Dans un ballon contenant 200 centimètres cubes d’eau peptonée stérile, on verse 5 à 6 centimètres cubes de bactériophage antistaphylococcique et une dizaine de centimèêtres cubes d’une culture de staphylocoques en eau peptonée, âgée de vingt-quatre heures.

2 On prend d’autre part deux tubes d’eau peptonée stérile (tubes 1 et 2) et dans chacun d’eux on ajoute 2 à 3 gouttes de bactériophage antistaphylococcique et 0,5 ec. d'une culiure de staphylocoques âgée de vingt-quatre heures. l

30 Dans un tube d’eau peptonée stérile (tube n° 3) on ajoute 0,5 ce. d’une culture de staphylocoques âgée de vingt-quatre heures. Les tubes 1, 2 et 3 vont servir de témoins.

49 On laisse ces trois tubes à la température du laboratoire (environ 200). C’est là une condition de réussite. Si en effet on opérait à l’étuve on risquerait très souvent ou de ne pas voir le phénomène se produire ou de laisser passer le moment exact où il faut arrêter l'expérience. En opérant à une température inférieure à 370, on ralentit la vitesse de culture du microbe et la vitesse de la lyse. Celle-ci se produit d’ailleurs très bien et d’une façon complète. Les tubes témoins (1, ? et 3) nous permettent de connaître le moment où l’on peut arrêter le phénomène. Il suffit de comparer, en effet, le tube 3 aux tubes 1 et 2. Ces derniers (staphylocoque + bactériophage) doivent être clairs, ne contenir aucun dépôt décelable par agitation ; le tube 3 (staphylocoque seul) doit être très trouble.

Le phénomène s’est accompli et si on regarde le ballon on s'aperçoit qu'il est parfaitement clair.

En opérant ainsi que nous venons de le dire il faut douze à quinze heures pour que la lyse Soit parfaite.

Il est nécessaire maintenant de stériliser (non pas d’ultra-stériliser) le bactériophage obtenu. Pour ce faire on va

filtrer.

c) La filtration. — C’est là une opération qui demande beaucoup de précautions et une grande habitude. Elle se fera à travers des bougies Chamberland L 3.

Celles-ci après régénération et vérification de leur étanchéité seront montées sur un appareil de Kitasato. Le tout sera stérilisé à l’autoclave à 1200 prendant quinze minutes. La filtration se fera sous une pression peu élevée (20 cm. environ) et devra, autant que possible, être menée rapidement, en dix ou quinze minutes. Il n’est guère possible de faire passer sur une seule bougie plus de 200 à 300 cc. d’eau peptonée ; on arriverait à un colmatage. Le liquide ne s’écoule plus qu'avec une extrême lenteur, et si l’on persistait on n’obtiendrait que de mauvais résultats. Aussi, quand on est obligé de filtrer 600 à 800 centimètres cubes deliquide, se sert-on d’un jeu de Kitasato. Il semblerait que cette filtration opérée, le liquide obtenu puisse servir pour l’usage thérapeutique. Il n’en est rien en réalité et il est nécessaire de procéder à la vérification de la stérilité du bactériophage.

d) Vérification de la stérilité. — A l’aide d’une pipette à boule on transvase stérilement le principe lytique filtré de Kitasato dans une série de grands tubes stériles, à raison d’une vingtaine de centimètres cubes par tube. On porte à l’étuve à 370 On vérilie après vingt-quatre heures. Si toutes les manipulations ont été faites proprement, les tubes sont clairs. Si par hasard une contamination s'était produite on jette les tubes infectés. Mais ce premier séjour à l’étuve n’est pas suffisant, on doit encore remettre les tubes à 570 et les y laisser pendant 6 à 7 jours. On voit, en effet, presque toujours apparaître des cultures secondaires après filtration. Que sont-elles ? Nous ne le savons pas ; Hauduroy, en étudiant ces cultures secondaires, apparues dans le filtrat de cultures de bacilles de Shiga lysées par le bactériophage, a pu constater qu'elles donnaient un trouble opalescent comparable au blanc d'œuf. Ce trouble examiné au début au microscope montrait qu'il était formé de petits

L'on D LS dé PE

grains ; plus tard, après repiquage, Hauduroy retrouvait du bacille de Shiga.

On comprendra facilement que dans les applications thérapeutiques, on doive par dessus tout éviter la présence de ces formes microbiennes. Nous ne connaissons pas leur pouvoir pathogène et nous avons, par conséquent, le devoir de les éliminer.

On pourrait objecter que certaines d’entre elles n'apparaissant qu'après plusieurs mois, un séjour de huit jours à l’étuve est insuffisant. Cette objection tombe devant le fait qu'un bactériophage absolument limpide, sans aucun trouble ni dépôt au moment de l'injection ne s’est jamais montré nocif et n’a jamais amené de réaction dangereuse.

La conservation à l’étuve du bactériophage pendant huit jours est pratiquement suffisante. On regarde soigneusement les tubes et on élimine ceux qui sont troubles ou même légèrement opalescents. (La pratique nous a montré qu’on perdrait en moyenne du fait de l'apparition des cultures secondaires après filtration, un bon tiers du bactériophage préparé. Il n'existe, à l'heure actuelle, aucun procédé pour obvier à cela).

e) La mise en ampoules. — 1e contenu des tubes qui sont restés clairs est mis en ampoules et subit encore un séjour de vingt-quatre heures à l’étuve. On élimine tout ce qui aurait pu être souillé au cours de cette dernière manipulation.

Les ampoules dont nous nous sommes servi étaient, soit de ? centimètres cubes pour les injections, soit de 10 centimètres cubes pour les pansements locaux.

v F ei, + Res