DOSAGE DES PRINCIPES ALBUMINOÏDES

les poids relatifs dos globules humides et du plasma, de se faire une idée très suffisante du partage de divers matériaux entre les globules rouges et blancs et la liqueur où ils nagent.

Dosage des matières albuminoïdes totales ; extraits aqueux, alcoolique; sels minéraux, etc. — On pèse 20 à H) gr. de sang, de sérum, ou de globules lavés à l'eau salée, suivant, qu'il s'agit de déterminer la composition du sérum ou des globules, cl on les délaye dans 4 vol. d'alcool froid à 83" centés. additionnés de k2 à 3 gouttes d'acide acétique. On laisse déposer 4 heures et Ton jette sur un filtre sans plis mouillé d'alcool. On lave le précipité à l'alcool chaud {Liqueur a), puis avec un mélange d'alcool et d'éther {Liqueur b), enfin avec de l'eau bouillante {Liqueur c). Après ces lavages, il ne reste sur le filtre que des substances albuminoïdes dont une partie est passée toutefois en {a). Nous la retrouverons plus loin. L'albumine coagulée restée sur le filtre est de nouveau reprise par de l'alcool, puis par de l'éther. Après ces divers traitements elle s'est rétractée; on peut alors la saisir à la pince, la placer sur un verre de montre, la sécher à 110° et la peser {Précipité A).

La liqueur a est évaporée à siccité au bain-marie et le résidu repris par la liqueur b. Il reste un faible résidu insoluble qu'on jette sur un petit filtre sans plis et qu'on lave à l'alcool absolu, puis à l'éther. Il consiste en une matière albuminoïde mêlée de sels qu'on enlève grâce à la liqueur c ci-dessus, puis par un dernier lavage à l'eau. On sèche ce résidu insoluble et on le réunit au précipité A.

Cette matière albuminoïde sèche totale A est alors incinérée avec les précautions ordinaires à basse température, d'abord à carbonisation en séparant par lixiviation les matières minérales solubles, puis au rouge pour obtenir les cendres insolubles. Le poids A, diminué des cendres solubles et insolubles ainsi obtenues, donne le poids des substances albuminoïdes totales séchées à 110°.

Les liqueurs alcooliques b et alcoolo-éthérées ci-dessus sont évaporées à siccité au bain-marie, puis dans le vide, et le résidu est épuisé par de l'éther sec. Cette solution éthérée renferme les matières grasses, la cholestérine et les lécithines ; on chasse l'éther et on pèse le résidu sec à 100°. La partie que l'éther ne dissout pas contient un peu d'urée, de glycose, de sels à acides organiques, de sel marin.

Enfin, l'extrait aqueux {Liqueur c) obtenu comme on l'a dit par lavage h l'eau bouillante du premier coagulum, renferme tous les principes du sang solubles dans l'eau et insolubles dans l'alcool et dans l'éther, principalement les sels minéraux ou organiques. On l'incinère pour connaître la nature et le poids des cendres et par différence celui des matières organiques.

Cette méthode,, qui s'applique aussi bien au sang total qu'à chacun^ de ses parlics, plasma ou globules, fournil une première détermination approximative de leurs matériaux constitutifs principaux.

Si ces constatations préliminaires ont été faites successivement sur les globules et sur le sérum séparés, on voit que, si Ton a déterminé préalablement les poids relatifs des «lobules humides cl du plasma (p. ill et 412), «n pourra rapporter à cbacunc de ces parties ce qui leur revient des divers principes ci-dessus mentionnés.

11 nous reste maintenant à dire comment on dose séparément chacun de ces principes constitutifs du sang.

Dosage de l'hémoglobine.— Deux procédés permettent de doser l'hémoglobine : les procédés optiques et les procédés chimiques.

Procédés optiques. — 1° Méthode speclrophotométrique. — Elle consiste à mesurer la diminution d'intensité que subit un faisceau de lumière homogène en passant à travers une solution d'hémoglobine, et à déduire de cet affaiblissement la concentration de la liqueur.

Partant de ce fait, que démontre l'expérience, que pour une mène épaisseur de corps colorant l'affaiblissement relatif de l'intensité lumineuse est constante quelle que soit l'intensité initiale, il est facile

d'établir la relation Y = où I' indique ce que devient l'intensité I du

rayon initial à sa sortie d'une lame de matière d'épaisseur c, si pour une

épaisseur = 1 l'intensité devient

Si l'on suppose l'intensité initiale 1 = 1, on a Y = — ou I' = n~e. (a),

Telle est la loi de l'absorption de la lumière pour des épaisseurs e variables d'une solution colorante quelconque.

Bunsen a nommé coefficient d'extinction e d'une solution colorée l'inverse du nombre exprimant l'épaisseur sous laquelle il faut examiner cette solution pour qu'elle réduise au 10e de sa valeur primitive l'intensité du faisceau originel. Ce coefficient e se calcule par des observations photométriques et une fois pour toutes. Si l'on suppose, en effet,

I' — J-, l'équation (a) ci-dessus donne ne = 10 ; d'où, en prenant les

logarithmes vulgaires : e log. n= l,ou log. n = -• Or, s =-.donc on

ae=log. n. ^ p

Pour une épaisseur e quelconque on a par suite, e = — — En par-

(!) n est donc le nombre exprimant l'inverse de l'intensité acquise après que la lumière a traversé un milieu d'épaisseur =1. On prend généralement pour unité l'épaisseur de 10 millimètres.

DOSAGE OPTIQUE DE L'HÉMOGLOBINE. /,I7 ticulier, si Ton observe sous une épaisseur de 1 centimètre (soit e = l), on aura e = — Iog. 1' = log.p ^

Il est facile de montrer que le coefficient d'extinction d'une solution est proportionne] à sa richesse c en matière colorante.

Il en résulte que si l'on désigne par c, c', c" les concentrai ions respectives d'une même substance, el par e, e', s" les coefficients d'extinction correspondants, on aura -=£.=£ — A

Cette quantité A, constante pour chaque substance colorante, a été désignée sous le nom de rapport d'absorption. On vient de montrer

que l'on a : X=t et il est facile de déterminer A, une fois pour toutes pour une concentration c égale à l'unité. Ce rapport varie un peu avec chaque sorte de lumière, et il est, suivant les cas, plus pratique de le rapporter à telle ou telle région du spectre. On le détermine en mesurant le coefficient d'extinction s d'une série de solutions de concentrations connues (Concentration = poids de substance active par centimètre

■ cube de liqueur). L'on a ainsi trouvé pour la lumière qui répond à la bande (3 de l'oxyhémoglobine, une valeur de A= 0,00100 pour l'oxyhémoglobine de chien ; 0,001105 pour celle de rat; 0,001014 pour celle

■ de porc; 0,0010 pour celle d'homme. Pour l'hémoglobine de chien li'on a : A=0. 001351; pour la carboxyhémoglobine, A=0, 001000; i enfin, pour la méthémoglobine, A = 0, 002798.

D'après l'égalité A = î, on aura c = As (e),

iqui donne la concentration c lorsqu'on connaît A, et lorsqu'on a déter-

i minés que nous venons d'apprendre à calculer d'après l'équation (b). Comme constatation expérimentale, s ne résulte que de la détermina-

Ition de l'intensité V d'une lumière d'intensité I après qu'elle a traversé mie couche de substance colorante d'épaisseur égale à l'unité et contenant l'unité de poids de cette substance dissoute dans l'unité de volume.

Les considérations précédentes s'appliquent à la mesure de l'intensité des suhstanecs colorantes en général. S'il s'agit particulièrement du

•sang, on mesure avec les précautions que nous avons indiquées à propos de la numération des globules (p. 408), 0CC,02 de sang qui, après avoir été dilué au 200e est placé dans une cuve à faces parallèles écartées de

111 millimètres. Dans la moitié inférieure de celte cuve est immergé un parallélipipède de flint de 1 cent, d'épaisseur. Deux faisceaux de lumière provenant d'une corbeille de zircone incandescente traversent, la première, la partie supérieure de la cuve ayant 1 1 millimètres d'épaisseur ; la seconde, la partie inférieure ne présentant qu'une épaisseur de 1 mm. de milieu colorant. Tout se passe donc comme si la lumière blanche A. Gautier. — Chimie biologique, 27

traversai en haut K> millimètres de matière colorante ef arrivail en bas toul à fait inaltérée. Le double faisceau ainsi obtenu tombe alors sur la fente d'un spectroscope spécial ou spectrophotomètre.

Il s'agit de mesurer l'intensité relative des deux faisceaux; pour cela, il Tant comparer non les spectres entiers, mais l'une de leurs parties] bien homogène. L'expérience a montré qu'il vaul mieux choisir la région où se forme, pour le sang oxygéné, sa deuxième bande d'absorption, (X=540 environ). Le reste du spectre est caché, dans le spectrophotos mètre, par des écrans spéciaux.

L'opérateur voit doue dans la lunette deux régions lumineuses : l'une inférieure répondant à une lumière presque blanche et éclatante, l'autre supérieure éclairée par le même faisceau lumineux, mais après qu'il a traversé 10 millimètres de sang dilué; il s'agit, pour calculer c d'après l'équation (e) ci-dessus, c = As, de recueillir les éléments de mesura du coefficient cl absorption e en rendant l'éclat de la région lumineuse inférieure égal à celui de la supérieure. On atteint ce but diversement dans chaque spectrophotomètre : je signalerai ici seulement ceux de Vierordt (le premier en date), de Violle et de Branly, qui sont les plus précis, enfin de Hûfner souvent employé. Je ne décrirai que le dernier, il donne des résultats exacts et il est facile à comprendre.

Dans l'appareil de Vierordt, l'affaiblissement de l'éclat du spectre inférieur le plus lumineux s'obtient par le rétrécissement de la partie clc la l'ente du spectroscope qui admet le pinceau de lumière. Dans celui de Hûfner, la fente reçoit deux faisceaux contigus, dont l'un polarisa par un nicol, arrive directement à l'appareil et à l'œil, tandis que l'autre! reste à l'état de lumière naturelle, et traverse la couche de sang dilué. L'oculaire possède à son tour un nicol analyseur dont la rotation se mesure sur un cercle. gradué. L'analyseur étant placé au zéro, on interpose sur le trajet du faisceau non polarisé la cuve contenant le sang(1)l Le faisceau polarisé n'ayant pas traversé le sang dilué parait plus brillant; l'observateur rétablit l'égalité entre les deux faisceaux supérieur et inférieur en tournant l'analyseur d'un angle a qu'on mesure sur un limite gradué. D'après la loi connue, qui relie l'intensité I' du faisceau polarisé à l'intensité I primitive et à l'angle a que forment les sections principales des deux niçois, l'on a r = ICos*a. Si l'observation a lieu pour 1 cent, d'épaisseur, et si l'on fait 1 = 1, Ton a

£ = — log. r= — 2 log. Cos y..

(l) Dans l'appareil clc Hûfner que nous décrivons ici, celle cuve n'est pas celle dont nous parlions plus haut, qui d'ailleurs peut aussi s'employer; le sang dilué contenu dans une au?rc à faces parallèles d'une épaisseur de 10 millimètres, n'est place que devant la partie inférieure de la fente du speclroscope, celle qui ne reçoit pas le faisceau polarisé.

DOSAGE OPTIQUE DE L'HÉMOGLOBINE. m

Les valeurs s et A ayant été ainsi déterminées une l'ois pour [unies pour l'oxy hémoglobine de diverses origines, on calcule la concentration c, pins haut définie, par l'équation c= As que nous avons établie ci-dessus.

2° Hémochromomètre de Maîassez. — Cet instrumenta subi divers perfectionnements. Son principe est le suivant : avec un mélange de carminatc d'ammoniaque et d'acide picrique on peut imiter dès exactement la couleur de l'oxyhémoglobine; les images spectrales de ces deux substances sont môme dès analogues. Si donc on détermine mie fois pour tontes la quantité d'oxyhémoglobine qui se trouve, par centimètre cube, dans un sang dont la couleur correspond exactement pour une épaisseur donnée au type de l'étalon de picrocarminate, on pourra, en comparant les divers sangs sous des épaisseurs variables, reproduire le ton du type adopté, de telle sorte qu'à volumes égaux ces sangs contiendront une quantité d'oxyhémoglobine inverse de l'épaisseur nécessaire pour obtenir la teinte étalon.

L'instrument se compose d'un écran rectangulaire porté sur un pied

i et percé près de son centre de deux trous de 5 millimètres de diamètre placés côte à côte. Derrière le trou de gauche se trouve l'étalon au picrocarmin dissous dans la glycérine; derrière celui de droite est

i une cuve prismatique d'épaisseur variable où l'on verse le sang d'avance

idilué d'eau distillée à un titre connu (du 50' au 200e suivant les cas).

I Une lunette et un prisme à double réflexion totale permettent à l'observateur de comparer les deux images colorées placées côte a côte. Elles

: sont éclairées par- un rayon de lumière réfléchie sur une plaque de

I faïence émaillée. Au moyen d'une crémaillière, on fait avancer ou reculer le prisme de sang jusqu'à ce que, grâce à la variation de l'épaisseur traversée, les deux images perçues par l'œil soient de même ton et de même intensité. Une échelle indique l'épaisseur du sang traversée et

i une table traduit cette épaisseur en quantité d'oxyhémoglotnne.

En divisant le poids de l'oxyhémoglobine contenue au millimètre cube

ipar le nombre des globules compris dans ce volume, on a la valeur moyenne d'un globule en oxyhémoglobine. Un homme sain donne par

i millimètre cube de sang 0gr000125 d'oxyhémoglobine; et par globule,

• en prenant pour unité le millionième de gramme, 0,000025.

3° Hémochromatomêtre de Eayem. — Cet appareil est très simple. I Une lame de verre porte deux petits anneaux de verre dépoli collés à sa surface et formant cuvettes. Dans l'une, on place le sang à examiner dilué ;ï un titre connu ; dans l'autre, on verse de l'eau distillée et l'on éclaire les deux augettes par de la lumière réfléchie, partant du nord autant que possible. Sous l'auge qui contient l'eau distillée, on fait passer

• successivement des rondelles de papier teintes à l'aquarelle d'une couleur

LE SANIj.

sang plus ou moins foncé, cl l'on s'arrête lorsque l'œil voyant à la l'ois les deux teintes du sang et du papier coloré, juge qu'il y a égalité. Si l'on a comparé ces teintes une l'ois pour toutes avec des sangs dont on avait, au préalable, déterminé le nombre de globules, on pourra, par une table spéciale, connaître le nombre de globules qui répond au sang qu'on étudie, et même (grâce à un coefficient à peu près invariable pour les sangs normaux) la quantité d'oxyhémoglobine correspondante. (Voir Hayem, le S.yxg, p. 43.) Ce procédé très rapide suffi! aux besoins de la clinique.

4° Hématoscope cVEénocque. — 11 est constitué par deux lame- de verre rectangulaires et planes posées de façon que, se touchanl par l'un de leurs bords (côté droit), elles s'écartent du côté opposé de 300 millièmes de millimètre. L'instrument se place contre une échelle graduée sur porcelaine qui porte deux divisions. Celle du haut indique la distance

15 % 15. '12 11 iO

Fig. 64.

des lames en millièmes de millimètre (chaque division de l'échelle divisée en millimètres correspond à une augmentation d'épaisseur de la cuvette interlamellaire de 5 millièmes de millimètre). La seconde division, placée au-dessous de la première est telle que ses chiffres indiquent directement en grammes la quantité d'oxyhémoglobine (calculée à 1 elat sec) qui se trouve dans 100 centimètres cubes du sang qu'on étudie.

Pour se servir de l'instrument, on fait une piqûre au bout du doigt cl l'on introduit 4 gouttes du sang qui s'écoule entre les lames de Finstruj ment où elles pénètrent par capillarité; il ne reste plus alors qu'à déterminer la division de l'échelle inférieure qui reste encore visible pour conclure la quantité d'oxyhémoglobine sèche contenue dans 100 c. ci de sang. Dans le cas représenté par notre figure 64 nous aurions 10 gr. d'oxyhémoglobine dans 100 de sang.

L'on peut adjoindre a l'instrument un spectroscope spécial et recourir aux phénomènes des deux bandes cd)solument obscures. Mais, dans ce cas. l'Iiématoscope perd sa simplicité et n'est plus, comme dans le cas précédent, un instrument de mesure rapide (').

(') Voir Compt. rend.. GUI, 817 et CYI, 146.