CHAPITRE IV

MÉTHODES DE CULTURE DES BACTÉRIES

Si l'on veut étudier de visu les phénomènes de la vie et du développement de certains microbes, il suffit parfois de mettre une petite" goutte d'un liquide de culture ou d'un liquide pathologique, recueillie avec toutes les précautions désirables, entre la lamelle et la lame porte-objet, et de l'examiner au microscope. Il est nécessaire d'observer durant un certain temps sur un porte-objet chauCfé ou sur la platine chauffante. L'un de nous a construit un appareil très simple pour obtenir une température constante sous le microscope. Il consiste en un porte-objet en cuivre assez volumineux, à double paroi, portant un trou central suffisant pour y mettre une lame de verre recouvert d'une lamelle. Il communique par deux tubes en caoutchouc avec le thermostat employé pour les cultures. On apprécie très bien ainsi les mouvements des micro-organismes. Si l'on a affaire à une bactérie qui se développe rapidement, on pourra constater sa reproduction par scission et les divers stades de son développement. S'il s'agit des bactéries du charbon par exemple, on verra, en examinant le bord de la préparation, c'est-à-dire la portion la mieux oxygénée, comment les bactéries s'allongent pour former des filaments.

Il est préférable de placer une gouttelette du liquide à analyser, avec un peu de substance nutrilive stérilisée, sur une lamelle mince et de la déposer à la surface d'une lame porte-objet excavée, creusée en cupule à sa partie centrale.

On borde alors la lamelle avec de l'huile d'amande fraîche ou de la vaseline, ce qui constitue une chambre humide.

Pour l'examen dans la chambre humide, on place une parcelle de la substance à examiner sur une lamelle mince, bien lavée et stérilisée sur la flamme, dans une goutte de bouillon de viande stérilisé et neutralisé. On renverse ensuite la lamelle sur une lame de verre porte-objet assez profondément excavée et dont l'excavation est entourée d'avance d'une couche épaisse de vaseline. La chambre humide ainsi constituée est la plus simple et la meilleure. On examine au microscope avec un objectif-^ de Zciss à immersion dans l'huile et avec le condensateur Ahbé muni d'un diaphragme à petite ouverture.

On peut employer aussi la chambre humide de Ranvier, danslaqulle le

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verre porte-objet offre à son centre un plateau circulaire entouré d'une rainure profonde. La gouttelette à examiner étant placée au milieu et recouverte de la lamelle, on borde le pourtour de la lamelle avec de la paraffine ou de la vaseline. La rainure renferme de l'air et un peu de liquide.

Ces chambres humides simples sont portées sur la platine chauffante. Nous avons construit une chambre humide analogue qu'on peut stériliser, qui communique à la fois avec l'air ambiant par un conduit et avec un réservoir d'eau distillée pour empêcher l'évaporation du liquide. Avec cette chambre humide, on peut suivre pendant plusieurs jours le développement des microbes, ou la placer dans une étuve pendant plus longtemps.

On peut aussi employer la chambre claire de Kiihne, qui consiste en un tube de verre dilaté en ballon à paroi très mince à son milieu. Ce ballon est lui-même aplati de telle sorte que les parois opposées arrivent presque à se toucher et qu'on peut le placer sur la platine du microscope, sous la lentille objective. La paroi aplatie du ballon n'est pas plus épaisse qu'une lamelle de verre mince à recouvrir. L'appareil étant stérilisé, on aspire le Uquide à examiner par une des extrémités du tube. Ce petit ballon aplati pourra être placé sur un porte-objet chauffé.

L'examen microscopique direct des microbes en voie de développement se fait aussi très facilement sur des lames de verre ou sur des cristallisoirs couverts d'une substance nutritive gélatinisée telle que le sérum gélatinisé, la gélatine peptone, l'agar agar, qu'on inocule avec les cultures ou virus contenant des bactéries. L'examen au microscope est utile pour étudier avec de faibles grossissements la forme et l'apparence que présentent les colonies de microbes dans leur groupement et leur accroissement.

Les procédés qui précèdent s'appliquent surtout à l'étude de très petites parcelles de liquides contenant des micro-organismes dont on veut étudier le développement. Mais pour faire des cultures de ces microbes en plus grandes niasses, on doit employer d'autres appareils et des substances nutritives stérilisées.

La façon la plus simple de faire ces cultures consiste à mettre un peu de la substance à examiner dans des vases stérihsés contenant des milieux nutritifs stériles.

Pour introduire le liquide qu'on suppose renfermer des microbes, on se sert d'un fil de platine chauffé au rouge, puis refroidi; on y trempe son extrémité et on l'introduit dans le bouillon liquide ou la substance gélatinisée appropriés à la culture, en se tenant dans l'atmosphère de la flamme d'une lampe à alcool. Puis on ferme le vase contenant la substance nutrive avec un tampon de ouate.

MÉTHODES DE CULTURE DE PASTEUR

MÉTHODES DK CULTURE DE Pasteuii (1). — PasteuF a fait le premier des cultures en employant des procédés à l'abri de toute cause d'erreur. Nous donnons d'abord ses procédés qu'on peut trouver dans ses diverses publications et dans celles de Duclaux, où nous avons emprunté la plupart de ces renseignements. Pasteur employa d'abord comme bouillons de culture des liquides variés, soit des liquides nutritifs artificiels, soit des infusions de viandes. En voici quelques exemples.

L'eau de levure est préparée avec de la levure fraîche de brasserie qu'on laisse en suspension dans l'eau, puis qu'on passe à travers un tamis de soie. On décante ensuite, on abandonne le liquide à lui-même pendant 24 heures, pendant lesquelles la levure se dépose. On décante le liquide trouble qui surnage. On délaye le reste dans un volume d'eau suffisant pour qu'il y ait SO à 100 grammes de levure par litre. Le liquide ainsi obtenu est filtré; il sort limpide du filtre, et s'il est louche, on ajoute un peu d'acide phosphorique qu'on salure ensuite avec de l'eau de chaux.

L'infusion de foin se fait en coupant le foin en paillettes et en le mettant dans l'eau bouillante pendant quelques minutes. On filtre ensuite. La liqueur est limpide et acide.

L'urine employée pour les cultures sera bouillie, puis neutralisée si elle est devenue alcaline, puis filtrée à chaud.

Les bouillons de viande se préparent avec delà viande de bœuf, de veau, de poule, etc., hachée, mise dans l'eau et portée lentement à l'ébuUilion. On verse sur un filtre mouillé. Si la matière grasse passe dans le filtre, on siphonne le bouillon après l'avoir laissé se refroidir. Le bouillon est un peu acide et doit être très limpide.

Les vases dans lesquels on recueille ces divers liquides sont tous fiarabés dans un fourneau à gaz en tôle du modèle ci-contre (fig. 5), dont la double boîte est chauffée directement parla flamme du gaz et qui contient un panier en fil de fer où l'on met les tubes, les flacons, ballons, matras et d'une façon générale tous les instruments à stériliser. La température de la caisse sera élevée

(l) Les méthodes de culture de Pasteur sont exposées dans les livres quo nous avons déjà cités sur le vin, la bière, etc. — Voyez encore Diiclaux, Ferments et maladies, Paris, 1882, et Encyclopédie chimique de Frémy, t. IX, 1883.

l'ig. 6. — Coupe du chaufToir employé pour flamber et stérilise les instruments et la verrerie.

MÉTHODES DE CULTURE DES BACTÉRIES

à ISO» ou 250°, ce qu'un thermomètre permettra d'apprécier, et tous les germes provenant de l'air seront cerlainement délruils dans les vases et sur les instruments placés dans l'appareil.

Kig. 7. — A, lubo i effilure horizontale. B, tube à effiliiro recourbée. a, b, col ; c, el'filure (figure empruntée à Duclaux).

Fig. 8. — Ballon à effilure supérieure.

Pour enfermer les bouillons dans des vases stérilisés, on aura d'abord

imbé dans le fourneau à gaz les tubes et les ballons.

Les tubes présentent sur un de leurs côtés une effilure horizontale ou

Fig. 0. — Ballon à effilure latérale et à col boucbé à la ouate. a, col du ballon bouché par de la ouate ; b, effilure latérale.

courbée en bas (B, a, fig. 7) dont l'e.xtrémité est terminée en pointe elfermée à la lampe. Leur col ouvert est bouché par de la ouate.

Les ballons présentent tantôt un col allongé et un corps sphérique ou à base un peu aplatie ; tantôt ils portent à la partie supérieure une effilure