MICROSCOPES

FirketS Hueppe et Ermangen', Crookshaok^, Sims Woodhead et W. Hare*, Uffreduzzi' etc. Nous nous contenterons d'indiquer ici les instruments, les réactifs et les modes de préparation qui sont nécessaires lorsqu'on étudie les micro-organismes.

Microscopes. — Il est nécessaire d'avoir un microscope solide, dont la yis micrométrique soit très bonne, qui soit pourvu d'un condensateur Abbé à grand angle d'ouverture et de lentilles à immersion dans Teau et dans rhuile (lentilles à immersion homogène).

Xous nous sommes servis des microscopes et des lentilles à immersion dans l'eau et dans l'huile fabriqués par Zeiss àléna, Vérick et Prazmowsky à Paris, Leitz à Wetzlar, Hartnack à Potsdam, Reichert à Vienne. Ross, Powel et Lealand, à Londres, fabriquent aussi des lentilles à immersion homogène.

L'emploi de verres spéciaux par Abbé et Zeiss a permis de faire des lentilles apochromatiques qui donnent des images plus claires, qui supportent des oculaires plus forts et qui fournissent les résultats les meilleurs pour la photographie.

Il est toujours nécessaire de commencer par examiner les préparations colorées avec un grossissement faible, de 50 à 100 diamètres, avec le condensateur Abbé et un diaphragme à faible diamètre pour étudier la topographie des lésions ; lorsque les coupes sont colorées doublement, les bactéries en violet par exemple, tandis que le tissu est teint en rouge, on peut déjà apprécier le siège des premières avec un grossissement de 100 à 200 diamètres par les taches et agglomérations violettes qu'elles présentent, ou même les reconnaître à. leur forme lorsqu'il s'agit de grosses bactéries comme celles du charbon. Il est même possible de très bien étudier avec un grossissement de 20 diamèti*cs la répartition des bactéries de la tuberculose lorsqu'elles sont en masses considérables, comme cela a lieu dans la tuberculose des poules et des faisans. Pour les grossissements de 50 à 300 diamètres, on peut se servir aussi des lentilles ordinaires et de la lumière directe donnée par un miroir concave.

Mais lorsqu'il s'agit de déterminer la forme et l'espèce des baclcrics, soit dans un liquide, soit sur des coupes, il est nécessaire d'employer des lentilles qui possèdent une grande clarté en même temps qu'elles grossissent de 300 à i 200 ou \ 500 diamètres. Les lentilles à immersion dans l'eau, avec la lumière simple et le condensateur Abbé, donnent de très bons renseignements pour les bactéries non colorées et étudiées dans les liquides, On peut aussi étudier les bactéries non colorées avec un condensateur Abbé

1. Firket a ajouté à sa traduction française du Traité de microscopie clinique de Bizzozero un chapitre relatif à la technique et au diagnostic des microbes parasitaires. Bruxelles, 1883, seconde édition française, 1885, et 3* édit. française, 1888.

2. HuEPPB et ËRMANOEN, traductîon française, 1»' vol. Steinheil, 1887.

3. Crookshank, an introduction to practical bacteriology, London, 1886, traduction française. Steinheil, Paris, 1887.

4. C. SiMS Woodhead et Arthur W. Hare, Pathological mycology, 1885. Section I, method.

3. Bordoni UPFREDtTzzi, Microparasitti. nelle malattie da infezione. Torino 1885.

CORNIL ET BABES. — 3^ ÉD. O

66 TECHNIQUE HISTOLOGIÔLE.

muni d'un diaphragme. Le meilleur microscope pour étudier les bacléries non colorées est assurément celui de Zeissou de Reichert avec les lentilles apochromatiques, avec la lumière Abbé et un diaphragme étroit.

Lorsqu'on examine des bactéries colorées, surtout sur des coupes, il est nécessaire de se servir de la lumière Abbé, et des objectifs à immersion homogène. Ceux dont nous usons le plus habituellement sont les lentilles ^ de Zeiss, le n» 10 de Vérick, le - de Reichert et le ^ de Leitz. Ces lentilles ont l'avantage de donner, en baissant ou élevant le tube, en changeant l'oculaire depuis l'oculaire n» 1 jusqu'au n*» 4, des grossissements qui varient de 300 diamètres à 1 000 diamètres. Pour les grossissements supérieurs, nous avons employé le n» 12 de Vérick, le ^ de Zeiss, le ^ de Reichert le fi de Leitz, ou le système 25 de Powel et Lesdand. Ces grossissements, sont très clairs, même avec l'oculaire n*» 4, le tube étant élevé. Les objectifs de Zeiss fournissent des images extrêmement claires et ti'ès précises; les plus forts grossissements sont donnés par Powel et Lealand. Le microscope de Powel et Lealand est muni d'un excellent porte-objet où la préparation est fixée et qui se meut de telle façon, à l'aide d'un vis, que tous les points de la préparation sont examinés successivement, sans qu'il soit nécessaire de la toucher. Un appareil semblable permet de noter et de retrouver un point spécial d'une préparation. Vérick fait aussi d'excellentes lentilles homogènes qui ont Tavantagc d'une distance focale assez grande; les lentilles de Leitz et surtout celles de Reichert que nous recommandons spécialement sont également très bonnes et coûtent beaucoup meilleur marché que les précédentes,

Le grand mérite du concentrateur de Abbé est non seulement de fournir une lumière d'une très grande intensité, mais aussi d'effacer le contour des cellules et des éléments non colorés en donnant une plus grande valeur aux parties colorées, aux bactéries, par exemple. Dans le concentrateur Abbé, les faisceaux lumineux sont rassemblés au sommet du cône qu'ils forment jn-ôcisément sur l'objet à examiner, c'est-à-dire au foyer de la lentille. Cos rayons, provenant de Tobjet à examiner, pénètrent dans la lenlillo sous un très grand angle d'ouverture. Il en résulte que les contours des cellules, masqués par la réfringence de la lumière, s'effacent et qu'on peut apprécier les plus fines bactéries colorées au milieu d'éléments à contours réfringents qui les masqueraient si l'on employait un autre éclairage. L'angle d'ouverture du cône des rayons mesure 120®. On peut régler l'appareil par des diaphragmes. Remarquons toutefois qu'un trop grand angle d'ouverture n'est pas toujours favorable, parce que tous les contours des objets peuvent devenir trop diffus. Nous conseillons aus^i les concentrateurs possédant un angle d'ouverture moindre qui sont appliqués aux microscopes de Zeiss et de Leitz. Ceux qui sont fabriqués par Vérick et Hartnack sont également utiles et permettent d'apprécier les éléments du tissu tout en observant très facilement les bactéries. Le même effet est obtenu dans les microscopes de Zeiss, Leitz et Reichert par l'interposition d'un diaphragme.

Les huiles dont on se sert ixjur les lentilles à immersion sont l'essence de cèdre, l'essence de fenouil, le mélange d'huile de ricin et de fenouil.

MICROT0M£S. 67

On emploie dans le même but l'hydrate de cliloral mélangé à la glycérine.

Instrcments de métal. — Verreries. — Les instruments dont on a besoin pour les préparations sont :

Des aiguilles eu acier, en platine et en verre. Nos aiguilles en platine sont montées sur un manche de bois, afûiées de telle sorte qu'on peut s'en servir pour toutes les préparations histologiques ; mais il est aussi commode d'employer un simple fil de platine monté sur une baguette de verre. On donne au fil la forme que l'on veut pour recueillir des liquides, pour faire des ensemencements sur la gélatine ou pour transporter les coupes minces d'un liquide dans un autre ;

Desspo/ti/es montées sur un manche de bois, très minces, ayant la forme d'un couteau de peintre courbé sur le plat à son extrémité. Elles doivent être en nickel, pour ne pas s'oxyder. On s'en sert pour porter les coupes minces d'un liquide dans un autre et pour les transporter sur la plaque de verre porte-objet. On peut se servir aussi de spatules de platine.

Des ciseaux fins ;

Despinces à extrémités fines, sans dents, qu'on emploie soit pour saisir les pièces dans les bocaux, soit pour tenir les lamelles lorsqu'on les chauffe sur la lampe à alcool ou qu'on les change de liquide ;

Des godets de cristal ou de porcelaine qui servent à faire baigner successivement les préparations dans les diverses solutions colorées, dans l'eau, dans l'alcool, dans l'essence de girofle, de térébenthine ou l'huile d'origanum. Ces godets de cristal ou de porcelaine doivent se recouvrir les uns les autres et s'empiler facilement, de telle sorte que les liquides qu'ils contiennent soient soustraits & l'évaporation ;

Des verres de montre ;

Des lamelles de 12 à 15 [x d'épaisseur;

Des lames porte^bjet lisses et excavées.

Suivant qu'il s'agit de préparations colorées ou non, les verres de montre, gpdets de cristal ou lames porte-objet doivent ôtrc mis sur une surface noire ou sur une surface blanche. Pour être bien éclairé, ce qui est nécessaire lorsqu'il s'agit de déplisser une coupe mince ou de faire des dissections fines, l'observateur doit se placer devant une fenêtre, et, si cela est nécessaire, examiner les objets sur le photophore de Ranvier.

MicaoTOMES . — Il est pour ainsi dire impossible de faire, avec le rasoir et à main levée, ou même avec les microtomes ordinaires, les coupes minces et larges dont on a besoin pour l'examen des bactéries. Celles-ci peuvent en effet ne siéger que sur un point d'une large préparation ; on est obligé pour les voir, lorsqu'elles sont peu nombreuses, d'examiner toute la surface d'une large coupe avec un grossissement de 500 diamètres ou même plus, ce qui nécessite une grande minceur de la préparation, 10 jx, par exemple. L'éclairage Abbé et les objectifs homogènes permettent de bien les voir même sur une coupe un peu épaisse. Aussi doit-on se servir d'un microtome. Ceux dont nous faisons usage sont des microtomes grand

modèle de Thoma, fabriqués par Jung à Heidelberg et ceux que conslruit Vérick à Paris.

Yérick avait fait autrefois, sur les indications de Rivet, un microtome en bois consistant en un plan oblique sur lequel on faisait monter la pièce à couper à la rencontre d'un couteau qui se mouvait horizontalement; Jung a établi plus tard, d'après les indications de Thoma, sur le même modèle, des microtomes de diverses grandeurs, en acier, très solides et d'un usage très simple.

Yerick et Luer fabriquent maintenant des microtomes Rivet en acier, et qui possèdent les mêmes avantages que ceux de Thoma.

Pour monter les pièces à couper sur le chariot qui les porte, on commence par faire durcir dans l'alcool la portion à examiner. L'alcool est le liquide durcissant qui conserve le mieux les bactéries, bien qu'il les contracte et diminue leur volume. Les fragments de tissus doivent être coupés régulièrement suivant des faces planes et parallèles et être durcis dans environ 50 fois leur volume d'alcoo). Il importe, pour que le durcissement se fasse bien, de prendre des tissus aussi frais que possible, recueillis avec des instruments stérilisés. Le fragment durci est collé à l'aide d'une légère couche de gomme ou de gélatine ^ sur un bouchon de liège taillé en hexaèdre ou sur un morceau de bois. La pièce, unie ainsi au bouchon ou au bois, est mise dans un Ûacon d'alcool à large goulot bouché à l'émeri. Quelques heures après, l'alcool a solidifié la gomme, et la pièce fait corps avec son support. Ce dernier est placé dans la pince qui surmonte le chariot du microtome, on mouille avec de l'alcool la surface de la pièce à couper, et on la fait glisser de manière à égaliser la surface de la pièce. Une vis micrométrique permet de faire avancer régulièrement le chariot de façon à obtenir, si la lame coupe bien, des coupes de 10 [i d'épaisseur. Ces dernières sont recueillies dans de l'alcool.

Pour examiner à l'état frais certains organes, le foie, les reins, le cœur, les poumons, on peut y faire immédiatement des coupes minces à Taide d*un couteau à double lame.

Le microtome à glace de Jung se compose d'un plateau métallique ({u'on refroidit en pulvérisant de l'éther à sa partie inférieure. La pièce à examiner est placée sur la plaque métallique et se congèle en s'y fixant. On peut alors y pratiquer des coupes minces avec le rasoir.

Le microtome de Roy présente une vis micrométrique qui monte à l'aide d'une roue dentée mise en mouvement par une manette. Il a été très avantageusement modifié par Malassez et Vérick, de telle sorte qu'en renversant l'appareil, on peut. faire les coupes dans une cuve contenant de l'eau alcoolisée. Les préparations se font par un mouvement automatique de l'opérateur, sans qu'il soit nécessaire de mouiller la pièce ou la lame du rasoir. On transforme facilement cet appareil en microtome à glace '.

1. On fait cette gélatine en dissolvant de la gélatine à chaud dans deux parties d'eau^ puis on ajoute deux parties de glycérine.

2. Malassez, Microtome perfectionné de Roy {Archives de physiologie^ 15 novembre 188i. **

RÉACTIFS UQUIDES.

RÉACTIFS UQUIDES. — Lcs priiicipaux réactifs dont on se sert constamment dans la préparation des bactéries sont :

!• Veau distillée, qu'il est très difflcile de conserver pure de toute souillure bactérienne. Nous ûltrons d'abord et faisons bouillir Teau distillée, puis nous la mettons dans un flacon de 2 litres, bouché à son col par un bouchon de caoutchouc. Ce bouchon est percé d un trou à travers lequel passe un tube de verre recourbé en bas et rempli de jouatc. La partie inférieure du flacon s'ouvre par un robinet en verre. Bien que le flacon ne soit jamais ouvert par le haut que pour le remplir, il contient souvent des bactéries fertiles ou non. Mais on peut les négliger, car, dans les opérations successives qu'on fait subir aux préparations, on ne les met dans l'eau distillée qu'après qu'elles ont subi l'action des couleurs d'aniline. Dans les coupes qu'on sort du bain colorant pour les laver dans l'eau distillée, les bactéries sont déjà colorées, l'opération du lavage est rapide, et si des bactéries de l'eau restaient par hasard sur la préparation, elles seraient incolores et par conséquent invisibles au microscope dans les préparations conservées dans le baume. C'est surtout pour la recherche bactériologique qu'il faut avoir de l'eau et d'autres liquides absolument stériles. La (ig. 3 représente un appareil contenant de l'eau stérilisée et servant à la fois pour mesurer la quantité employée. On stérilise d'abord les parties en verre, qu'on remplit ensuite avec de l'eau stérilisée. On ajoute les parties de caoutchouc et on stérilise de nouveau dans l'étuve à vapeur de Koch, fig. 16. Le môrae flacon sert aussi pour d'autres liquides nécos- Fio. 4.— Flacon pour saires à la recherche des bactéries (Babes).

2° Des acides, l'acide nitrique, l'acide acétique, l'acide chlorhydrique, l'acide sulfureux, etc. ;

3® Des bases, la potasse caustique, l'ammoniaque, le carbonate de soude et de potasse, l'acétate de potasse;

4<» L'huile d'aniline employée à faire l'eau d'aniline d'Ehrlich, la toluidine utilisée dans le même but (Babes);

5° L'alcool et en particulier l'alcool absolu, qui sert à décolorer et à déshydrater les préparations colorées par l'aniline;

6® L'essence de girofle, les essences de bergamote, d'origanum, de térébenthine employées à déshydrater les préparations;

7» Le xylol, l'essence de cèdre ;

8« Le baume du Canada qui sert à enfermer les préparations *.

L'alcool absolu et l'essence de girofle sont d'un emploi constant; nous

les liquides stérilisés.

L^ liquide est mis d'avance dans la pipette, graduée. Par une pression latérale sur le petit tube de caoutchouc qui lie la pipette arec le compte-gouttes, on peut bien régler la sortie des liquides. Le compte- gouttes dessiné possède une ouverture latérale qui s'ouvre par une faible pression sur le tube de caoutchouc.

1. 11 est avantageux de se servir de baume de Canada pur renfermé et conservé dans les tubes métalliques analogues à ceux où Ton garde les couleurs à Thuile.

les conservons dans des flacons compte-gouttes qu'on doit toujours avoir sous la main quand on monte les pièces.

Knfin toute la série des matières colorantes (voy. plus bas).

Hécolte des liquides a examiner. — Il faut toujours être muui, surtout lorscju'on va cherclier des liquides dans une salle d'hôpital pour les transpoiter ensuite au laboratoire, de pipettes propres à les recueillir. Pour préparer ces pipettes, on prend un tube de verre de 5 à 10 millimètres de diamètre; on le divise en morceaux de 20 centimètres de longueur; on chauffe au chalumeau la partie moyenne d'un de ses segments; on l'étiré en Teffilant et on a ainsi deux pipettes terminées par une extrémité capillaire qu'on ferme à la lampe, et ouvertes à l'autre extrémité. On bouche cette dernière avec de l'ouate fine et stérilisée ; on chauffe la pipette de nouveau au chalumeau pour la flamber et détruire les germes qui

FiG. 6. — Pipette à ventre renflé (figure empruntée aa traité de Duclaux, Ferment» et maladies).

pourraient y être restés. Pour plus de sûreté on pourra mettre ces pipettes dans lepoélc à flambera 160°. Pour s'en servir, on commence par flamber, à la lampe à alcool, toute la partie de la pipette comprise entre sou extrémité fermée et on la plonge immédiatement dans le liquide à recueillir, par exemple un abcès, au moment de son ouverture, dans une bulle d'érysipèle, etc. On peut aussi se servir de la seringue de Koch qui se stérilise très facilement et qui possède, au lieu de piston, une boule de caoutchouc.

Il vaut encore mieux, pour recueillir le liquide de ces collections, cautériser l'épiderme avec une baguette de verre chauffée à la lampe, casser l'extrémité très effilée du tube, la chauffer à la lampe, et l'introduire directement dans la collection liquide à travers l'épiderme ou même le derme, avant l'ouverture pratiquée ])ar le chirurgien. Le liquide monte immédiatement dans le tube par capillarité ou par suite de la raréfaction de l'air dans son intérieur. Si l'ascension n est pas assci rapide et si l'on a besoin de recueillir une certaine quantité du liquide, on aspire avec la bouche.

L'opération faite, on ferme l'extrémité du tube à la lampe. Il est bon que cette partie soit très mince, car alors on n'a pas besoin de chauffer beaucoup, tandis que si l'extrémité du tube est épaisse, il faut, pour la

Fui. 5. ~ Pipette à col tordu.

a, ouate ; b, col tordu ; -, extrémité de la pipette.

fondre, une certaine température, et on osl obligé de la chauffer à un degré qui peut être nuisible aux bactéries contenues dans le liquide.

La forme de ces pipettes sera modiflée suivant les besoins. Ainsi on prendra des pipettes à coi tordu (fig. 4) pour empêcher le liquide recueilli d'aller dans la partie du col bouchée à la ouate. Si Ton doit recueillir une grande quantité de liquide, de 20 à iOO grammes par exemple, on emploiera une pipette à ventre renflé (voy. fig. 5) ; si au contraire on no doit prendre qu'une ou deux gouttes, on se munira de pipettes semblables à celles usitées pour transporter le vaccin. Ces dernières sont très minces, ouvertes et terminées à leurs deux bouts par des extrémités effilées. On casse leurs deux pointes, on les passe à la lampe avant de s'en servir, on les remplit, après quoi on ferme à la lampe les deux extrémités.

Les liquides ainsi recueillis seront conserN'és jusqu'à ce qu'on soit prêt à en faire des lamelles à colorer ou des cultures ; mais il vaut mieux préparer les lamelles de suite et faire les cultures le plus tôt possible.

Pour recueillir de l'urine en vue de savoir si elle contient des microorganismes, il convient de faire un premier examen au microscope. Il est ilifficile d'éviter, chez les femmes, que les urines ne soient souillées au passage par le contact du mucus vulvo-vaginal et par les bactéries qui s'y trouvent. Chez l'homme, on doit laver au préalable l'extrémité de Turèthre avec de l'eau et avec de l'alcool. On recueille sur une lamelle une gouttelette d'urine à la fin de l'émission. Cette petite gouttelette est étalée sur la lame mince avec un fil de platine stérilisé, puis séchée à l'air ou à i'étuve. On la colore ensuite comme il sera dit bientôt. Si l'on est dans la nécessité de sonder les malades, il faut que la sonde métallique, très propre, ait été stérilisée dails l'eau bouillante. On pourra alors recueillir l'urine dans un vase stérilisé mis en communication directe avec la sonde.

Les précautions précédentes sont nécessaires si l'on doit transi)ortor les liquides ; mais il est préférable de les prendre avec une aiguille lie platine, de faire immédiatement les préparations et d'ensemencer de suite les substances nutritives sur lesquelles on veut faire germer les bactéries.

Chez les animaux, le sang devra être recueilli d'après le procédé de Pasteur que nous avons indiqué déjà (voy. page 26).

Pour les liquides provenant de ponctions de la plèvre, des articulations, du péritoine, il suffit d'employer les trocarts, tubes et vases bien stérilisés, des appareils ordinaires de Polain, Dieulafoy, etc.

MÉTHODE DE PHEPARATION ET DE COLORATION DES BACTÉRIES DANS LES LIQUmES

ET DANS LES TISSUS. — Il cst difficile de bien voir les microbes dans les liquides et surtout dans les tissus et dans les organes; aussi est-il nécessaire de connaître exactement tous les récents progrès de la technique histologique. La relation des microbes avec les éléments des tissus et les altérations de ces derniers nous donnent parfois, en effet, la clef de leur mode d'action pathogénique.

La première règle à poser, dans ces recherches, c'est l'obj^erv^ation de , la propreté la plus minutieuse, car l'air, l'eau, la poussière, avec lesquels

les objets à examiner sont en contact, contiennent des micro-organismes qu'il est essentiel de ne pas confondre avec ceux des maladies. Il faudra, dans ce but, laver les instruments dont on se sert dans deTalcool pur, ou mieux les chauffer jusqu'à 150 ou 200<».

Exj\men des liquides. — Pour Texamen des sécrétions, pour le pus, le mucus, etc., il est bon de ne pas prendre lacouchc superficielle, mais bien celle qui est en rapport avec les tissus altérés. On étale ces sécrétions sur une lamelle mince à Taide d'un ftl de platine qu'on a porté préalablement au rouge et laissé refroidir.

On peut mettre tout d'abord la gouttelette du liquide à examiner sur une mince lamelle qu'on renverse ensuite pour la placer sur une lame porte-objet excavée ou sur la chambre humide de Ranvier*; on entoure le bord de l'excavation de la lame porte-objet avec de la vaseline ou de la paraffine. On étudiera de cette façon les mouvements et certains stades du développement des bactéries : il sera souvent nécessaire, dans ce but, de placer le porte-objet ainsi disposé sur la platine chauffante de Ranvier. Il suffit, dans bien des cas, d'examiner simplement le liquide placé entre la lame et la lamelle.

Il est très important d'examiner les éléments des tissus à l'état frais en se servant d'instruments stérilisés. On stôrilisc les instruments dont on doit faire usage en les plaçant dans une boite de fer bien fermée qu'on laisse une demi-heure dans l'étuve à la température de 140*. Si Ton veut examiner un organe, comme le foie ou le poumon, on en fait une première coupe avec un couteau chauffé au rouge. On déchire, par traction entre les deux mains, et on prend avec un fil de platine un peu du suc de cet organe avec un couteau stérilisé. L'examen de ce suc sera fait en partie par le microscope, en partie par les cultures.

Un moyen pratique pour recueillir le sang consiste à laver la peau du doigt avec une brosse, de l'eau et du savon. On trempe le doigt dans un flacon contenant du sublimé à 7^ pendant quelques minutes. On lave le point que l'on doit piquer en faisant couler goutte à goutte de l'alcool absolu. Cela fait, on enveloppe le doigt avec du papier Joseph stérilisé, puis on pique la peau avec une épingle ou une lancette flambée. Ou fait sortir ainsi une gouttelette de sang qu'on aspire avec une pipette dont on a coupé la pointe et qu'on vient de passer dans la flamme. On aspire le liquide en ayant soin que l'extrémité de la pipette ne touche pas l'épiderme. Pour fermer on présente le bout de la pipette dans la flamme et on aspire de façon à éloigner le sang d'un centimètre environ du bout de la pipette; on ferme ensuite à la lampe.

Suivant une méthode indiquée déjà depuis longtemps par Ehrenberg* et Obormcier, et généralisée par Koch, une couche très mince de ces liquides est étalée sur des lamelles minces et desséchée rapidement. Pour mieux fixer la substance ainsi étalée, on la passe trois fois dans la flamme