E3UMEN DES TISSUS SUR LES COUPES

d'une lampe à alcool. Les lamelles ainsi préparées sont traitées par les substances colorantes comme les coupes minces des tissus.

Ces lamelles se conservent pendant des mois ou môme des années.

Souvent il sufût de mettre pendant quelques minutes une goutte de la matière colorante d'aniline sur la face de la lamelle recouverte du liquide desséché, de la laver ensuite avec de Teau distillée stérilisée et de Texaniiner immédiatement en la déposant sur la lame de verre porte-objet.

Pour l'examen de beaucoup de micro-organismes, il sera nécessaire de laisser les lamelles pendant une heure ou davantage dans des solutions colorantes. Dans ce but, on remplit aux trois quarts un verre de montre avec un bain colorant et on place les lamelles à la surface du liquide, de manière que la face de la lamelle qui porte le liquide desséché trempe dans le liquide. Après qu'elles ont été ainsi colorées, on lave les lamelles dans l'eau et on les examine dans ce liquide, ou bien on les dessèche et on les examine dans le baume, ou bien on les traite par la série des mômes réactifs que nous indiquerons à propos des coupes.

Examen des tissus sur les coupes. — Pour examiner les tissus, on en détache un segment avec un couteau chauffé au rouge, on met ce segment dans le microtome à congélation de Jung (de Heidelberg) et on en fait des coupes : ou bien on durcit un pareil fragment dans l'alcool, ou dans le bichromate de potasse et l'alcool.

Pour les dents et les os, on met des lames assez minces de ces tissus dans le liquide de Kleienberg.

Solution saturée d'acide picrîque 100 grammes.

Acide sulfurique 3 —

Filtrez et ajoutez :

Eau 300 —

Cette solution durcit les tissus en les décalcifiant.

Si la pièce à décalcifier a d'abord séjourné dans l'alcool, on en suspend un fragment dans un vase contenant une solution concentrée d'acide picrique, en laissant un excès de cristaux d'acide picrique au fond du vase.

L'action à la fois fixative et durcissante de l'acide osmique est parfois utile pour mettre en évidence certaines bactéries. La méthode de fixation de Flemming est avantageuse pour les cellules et pour certaines bactéries. Elle consiste à mêler l'acide osmique avec facide chromique, par exemple, 0,02 d'acide osmique, 0,25 d'acide chromique, 0,0 i d'acide acétique et 68 parties d'eau distillée; on y laisse les petits fragments de tissus pendant un ou plusieurs jours, après quoi on les place dans l'alcool.

Pour obtenir un durcissement avec l'alcool seul, il faut placer un petit fragment de pièce dans une grande quantité d'alcool *. Si la pièce n'est pas assez durcie, on la met pendant 12 heures dans un mélange à parties

1. CoRNiL, Instruction sur le mode de conservation des pièces anatomiques destinées à être examinées au microscope. Société anat.1884.

74 techmqi:e histologioue.

égales de solution de gomme sirupeuse et de glycérine, puis dans ralcool.

Si les tissus contiennent des parties fragiles ou privées d'adhérences solides avec la masse du tissu, comme des couches d'exsudation superficielle, des liquides enfermés dans des abcès ou des kystes, etc., il faut se servir, pour monter les pièces, de substances liquides susceptibles de se coaguler dans les tissus. La substance de Kalberlé, qui consiste dans l'albumine de l'œuf coagulée, n'est pas propre à ces examens, parce que les parties de cette substance qui ont pénétré la préparation se colorent fortement et sont difflciles à distinguer des exsudations pathologiques.

La celloîdine dissoute dans un mélange d'une partie d'alcool et d'une partie d'éther donne de meilleurs résultats, mais elle a l'inconvénient de simuler par places l'existence de la matière hyaline et de gêner par sa présence la coloration des bactéries. Pour monter les pièces dans la celloîdine, on commence par les laisser séjourner pendant 21 heures dans de l'alcool absolu ou dans un mélange d'alcool et d'éther; puis on les porte dans une solution très faible de celloîdine dans un mélange à parties égales d'alcool et d'éther, pendant 24 heures, puis on les met dans une solu* tion assez forte, de la consistance du miel, de celloîdine dissoute dans l'alcool et réther. Ce liquide est mis, avec la pièce à examiner, dans une petite boîte en papier fort de 2 centimètres cubes environ; on place la petite boite dans de l'alcool faible qui solidifie la celloîdine. La celloîdine coagulée est ensuite collée avec de la gomme sur un bouchon. On peut faire alors des coupes de la pièce au microtome.

Nous recommandons, pour monter les préparations, la paraffine chloroformée qui nous a donné les résultats les plus satisfaisants. Les pièces durcies dans l'alcool absolu sont placées dans la paraffine dissoute par le chloroforme. L'excès de chloroforme s'évapore, et.il reste une masse à demi solide qui se conserve pendajit plusieurs semaines. Après un séjour d'un jour dans cette masse, la pièce est placée dans de petites boites en carton mince qu'on remplit de paraffine en fusion. On choisit la paraffine pure, fondant à une assez basse température, connue sous le nom de paraffine solaire. Cette dernière, devenue solide, est montée dans le microtome.

A la place de paraffine chloroformée on peut d'abord mettre la pièce sortant de l'alcool absolu, dans de l'essence de bois de cèdre, liquide qui pénètre les tissus en conservant très bien leurs éléments (H. Lee et Henneguy). Après un séjour de 24 heures, les objets sont placés dans un bain formé d'essence de cèdre et de paraffine fondant ii une température de 35', (ju'on laisse à cette température constante dans un bain-marie ou une étuve, jusqu'à ce «ïu'ils en soient pénétrés. De là, les objets sont mis dans de la paraffine pure contenue dans une boîte en papier et montés pour le microtome.

Si la pièce était colorée avant d'être montée, on place immédiatemeat la coupe sur la lame porte-objet ou on l'enferme dans le baume mêlé au xylol. Si la coupe n'est pas colorée, il faut la mettre dans l'essence de térébenthine, puis dans l'alcool absolu et ensuite dans la matière colorante. On obtient ainsi de très belles préparations.

Il est bon de faire des coupes aussi grandes que possible. Parfois la mollesse ou la fragilité des tissus, même après qu'ils ont été durcis par

Talcool, oblige à faire des coupes un peu épaisses; mais eu géuéral il vaut mieux avoir des coupes très minces sur lesquelles on verra plus nettement toutes les bactéries et les éléments des tissus.

A mesure qu'on fait marcher le microtome, on transporte les coupes dv la lame tranchante dans une cupule remplie d'alcool. Il est bon de laisi^or^ les coupes dans ce liquide, parce que plus tard, lorsiju'on les portera dans •un bain coloré aqueux, elle se déplisseront d'elles-mêmes et s'étaleront dans le liquide où elles doivent se colorer. Il faut toutefois ne pas laisser séjourner longtemps les coupes dans Talcool, car certains microbes ne pourraient plus se colorer.

Les instiniments dont on doit se servir pour transporter les coupes d'un liquide dans un autre, pour les étaler sur les lamelles, seront d'une propreté minutieuse. Il faut faire usage d'aiguilles de verre ou de platine lorsqu'on met les coupes dans l'acide nitrique au tiers, et d'une façon générale l'aiguille de verre ou de platine à l'avantage de ne pas s'accrorher aux coupes, parce qu'elle reste toujours très lisse, n'étant pas oxydée. Les spatules dont on use pour transporter les pièces et pour les étaler sur les lames seront en nickel ou en platine.

Los coupes faites à l'aide du microtome à congélation sont moins commodes à traiter ensuite par les réactifs que celles qu'on obtient après durcissement par l'alcool. Elles sont en effet souvent couvertes de bulles d'uir, plus altérables par les acides qui les gontlent ou par l'alcool qui les fait se contracter.

Coloration dks bactéries. — L'examen des préparations d'un liquide contenant des bactéries nous fournit déjà, ainsi que nous l'avons dit i)récédemment, des renseignements très importants sur la forme, le nombre, la disposition et les mouvements des bactéries qui y sont contenues. L'étude des coupes dans l'eau additionnée de sel marin ou dans le sérum iodé montre aussi quelquefois des bactéries quand elles sont volumineuses; mais il faut toujours avoir recours aux colorations pour compléter l'analyse, qu'il s'agisse de bactéries isolées dans un liquide ou de coupes de tissus.

Lorsqu'on étudie des bactéries prises dans un bouillon de culture ou dans un liquide pathologique, après avoir enfermé le liquide à examiner entre la lame et la lamelle, on peut essayer de le colorer d'abord simplement en mettant une goutte de solution aqueuse faible de violet de métliyl R entre les deux lames de verre ou sur une lamelle couverte du liquide à moitié desséché et qu'on renverse ensuite sur la lame porte-objet en enlevant, avec une feuille de papier Joseph, le liquide colorant qui déborde la lamelle (Babes). Les bactéries se teignent d'une façon beaucoup plus intense que le liquide qui les entoure. Cette méthode de coloration des bactéries vivantes est assurément la meilleure pour les étudier à l'état frais et pour mesurer leurs diamètres. Là, en effet, elles ne sont contractées par aucun réactif, et elles paraissent plus volumineuses que dans les préparations durcies par l'alcool ou traitées par la dessiccation. Leurs mouvements continuent un certain temps, vingt-quatre heures, par exemple, pour les bacilles en vir-

76 TECHNIQUE HISTOLOGICJUE.

gule du choléra ; leur protoplasma est vivant, élastique, et malgré la coloration, certaines vivent et se développent. On peut étudier ce développement en chauffant la platine du microscope à 35°. On apprécie très bien la différence de couleur entre le protoplasma et les grains plus colorés. En un mot cette étude des bactéries colorées entre les deux lamelles à Tétat frais donne des renseignements très exacts sur leur physiologie et sur leur manière d'être dans les cultures et les tissus. Le mouvement de certaines bactéries s'arrête quelques secondes ou quelques minutes après qu'elles ont été teintes par les couleurs d'aniline.

Pour colorer les microbes contenus dans une culture ou dans un liquide obtenu par le raclage d'un tissu, ou dans le sang, la méthode la plus simple consiste à étaler sur une lame de verre une très faible quantité de ce liquide en une couche très mince. On fait sécher à l'air ou à l'étuve ou on passe au-dessus de la flamme d'une lampe à alcool. Avant que la dessiccation ne soit complète, on ajoute une ou plusieurs gouttes de solution aqueuse faible de violet 6 B ou du bleu de LOffler. On enlève avec de l'eau le surplus de la couleur, en ayant soin de ne pas enlever en môme temps les parties à examiner contenant les microbes.

Cela fait, on recouvre d'une lamelle et on observe au microscope. Les organismes sont bien colorés, et ils jouissent encore de leurs mouvements. Cette méthode simple est la meilleure pour les étudier car on peut les voir ainsi sans altération due à l'alcool ou aux essences qui les contractent et les diminuent dans la proportion d'un tiers ou de moitié leur diamètre transversal. Lorsqu'on a ainsi une bonne préparation dans l'eau, on peut la conserver en mettant des cristaux d'acétate de potasse au bord de la lamelle. Ceux-ci se dissolvent rapidement et, rendant liygrométrique le liquide contenu entre la lame et la lamelle, empêchent sa dessiccation.

Les procédés de teinture des coupes de pièces durcies et de liquides desséchés en minces couches sur les lamelles sont très avantageux pour l'étude des bactéries ; mais on ne peut voir de cette façon leurs mouvements. De plus les bactéries sont rétractées par leur séjour dans l'alcool.

Les différentes couleurs employées sont :

(a) Le CARMIN, qui colore en rouge pâle certains microbes ronds. Le carmin aluné ou borate colore mieux que le picrocarminate les microbes arrondis, par exemple ceux de la pyémie. On prépare le carmin borate de la façon suivante d'après Grenacher. A une solution de borax à 4 pour 100 d'eau distillée, on ajoute 4 pour iOO de bon carmin et on chauffé deux fois jusqu'à l'ébullition. On ajoute au liquide chaud une quantité égale d'alcool à 70^. On laisse reposer pendant cinq jours et on filtre.

Pour se servir de ce liquide, on y laisse les coupes pendant une minute, on les lave dans l'alcool à lO'* additionné d'une solution à 2 pour iOOO d'acide chlorhydrique pur, puis on les monte dans le baume après les avoir fait passer par l'alcool et par l'essence de girofle. Nous verrons bientôt que le picrocarminate d'ammoniaque, tel que le prépare Ranvier, est un des meilleurs agents pour obtenir une double coloration des coupes contenant des bactéries. (Babes, 1883, Woigert.)

Le picrocarmin de Orth se prépare en faisant dissoudre 2 parties et demi de carmin n^ 40 dans 97 parties et demie de solution [saturée de carbonate de lithium. On j ajoute 20 parties d'eau saturée d'acide picrique et on peut s'en servir immédiatement.

(b) Hématoxyline. — Cet agent, tel qu'il est préparé suivant le procédé de Ranvier, colore mieux que le carmin tous les microbes ronds, mais n'a généralement pas d'action sur les bacilles et sur les autres bactéries. L'hématozyline pure (sans alun) a été employée en solution concentrée, par Kocb, pour colorer le Ûagellum des bactéries. Celui-ci ne se colore pas par les couleurs d'aniline employées pour colorer le protoplasma des micro-organismes. Dans des coupes durcies par l'acide osmique, les bactéries, et surtout les capsules de certaines bactéries (bactéries du rhinosclérome), se colorent d'une manière très nette.

(c) L'ioDB dissous dans une solution d'iodure de potassium sert à teindre le protoplasma du bacillu$ amylobacter et des autres bactéries qui possèdent la réaction de l'amidon. Il est utile pour l'étude des champignons, des moisissures en particulier.

La solution d'iodure de potassium iodé (1 gramme d'iodure de potassium pour 20 grammes d'eau avec addition d'iode métallique à saturation) sert à fixer les couleurs d'aniline sur les micro-organismes, de telle sorto que l'alcool employé ensuite décolore les tissus colorés par l'aniline, tandis que les bactéries restent colorées (première formule indiquée par Gram).

(d) Couleurs d'aniline. — On peut distinguer deux espèces de couleurs d'aniline, les unes dont le principe colorant est alcalin comme les dérivés de rosaniline (fuchsine, violet de méthyl, de gentiane, etc.), de triphényl de rosaniline (safranine, magdala, brun de Bismarck, etc.], et les couleurs acideSy comme l'éosine, la purpurine, la coccinine, le noir d'aniline, etc. <.*es couleurs sont employées en solution aqueuse ou en solution alcoolique faible.

Pour s'assurer qu'on a affaire à des couleurs pures, on étale des poussières de ces couleurs sur du papier à filtre. On mouille la surface opposée du papier et on voit souvent apparaître alors des points de couleur différente (Ehrlich). En examinant à la loupe par exemple, ou reconnaît que les violets sont souvent môles avec du bleu, du rouge, du vert.

Violet de méthyl et de gentiane dans une solution d'huile d'aniline. — Les couleurs que nous avons le plus souvent employées sont le violet de méthyl B (de Bàle), le violet 6 B et le violet de gentiane en solution aqueuse. 11 est préférable de se servir, au lieu d'eau pure, pour dissoudre la couleur, d'une solution aqueuse d'huile d'aniline (5 grammes d'huile d'aniline pour iOO grammes d'eau distillée), qu'on agite en la chauffant légèrement et qu'on filtre. On ajoute alors ii pour 100 d'une solution alcoolique saturée de violet et 10 pour 100 d'alcool absolu. On laisse dans cette solution les lamelles et les coupes pendant un temps variable suivant les bactéries qu'on veut étudier.

On emploie ensuite Tud des six procédés suivants :

1» Les objets colorés sont lavés rapidement à Veau distillée, puis décolorés dans Talcool pur jusqu'à ce qu'ils deviennent presque incolores. On les traite ensuite par Tessence de girofle, et on les monte dans le baume. Par ce procédé les noyaux restent colorés, ainsi que beaucoup dé bactéries; les capsules des bactéries de la pneumonie sont aussi colorées.

2<» Après la coloration des coupes, on lave à Teau distillée contenant une très faible quantité de sel marin. On porte la coupe sur une lame porte-objet et on la touche avec du papier Joseph pour enlever le surplus de Feau colorée. On laisse ensuite tomber sur la coupe quelques gouttes d'huile d'aniline qui se colorent fortement. On enlève cette aniline colorée qu'on remplace par quelques gouttes d'aniline et ainsi de suite et jusqu'à ce que la coupe soit transparente. On met alors du xylol qui lave la coupe, on ajoute une goutte de baume dissous dans le xylol et on recouvre de la lamelle (Ehrlich et Weigert).

3® Lorsque les objets ont été colorés par un séjour d'un quart d'heure dans le bain colorant, on les place pendant quelques minutes dans la solution d'iodure de potassium iodé (Gram), composée ainsi qu'il suit :

Iode 1 gramme.

lodure de potassium 2 —

Eau distillée 300 —

Ils y deviennent brun foncé. On les décolore ensuite par l'alcool pur, puis on achève leur déshydratation à l'essence de girofle et on monte dans le baume.

4^^ On place les coupes dans un bain de violet de méthyl ou de gentiane pendant quelques heures. On les lave à l'eau distillée et on les place pendant une minute dans une solution de bichlorure de mercure à 1 pour !00 d'eau distillée, avec addition d'une quantité d'alcool suffisante pour dissoudre le bichlorure. Ou lave à l'eau distillée, puis à l'alcool absolu. Les bactéries restent alors seules colorées, de môme qu'après l'action de la solution iodée. On achève la déshydratation dans l'essence de girofle et on monte dans le baume. (îram a montré au congrès de Copenhague (1884) de très belles préparations des bactéries de la fièvre typhoïde obtenues par ce procédé, que nous avons employé depuis avec avantage.

Les préparations décolorées par l'alcool sont éclaircies soit par l'huile de bergamote soit par l'essence de girofle.

Les préparations traitées par le procédé de Gram avec la solution iodée sont très instructives. Tout est devenu incolore à l'exception des bactéries. On peut voir ainsi presque toutes les bactéries, celles de la tuberculose^ de la lèpre, du choléra, etc. Mais la métliode de Gram est surtout excellente pour colorer les bacilles de la septicémie des souris, de l'œdème malin et du charbon, les bactéries du rhinosclérome, de la diphtérie, les streptococci de l'érysipèle et du phlegmon, les staphylococci de la suppuration. Dans la plupart de ces maladies il suffit de laisser les coupes un quart d'heure dans le bain colorant, mais pour d'autres, comme le rhinosclérome, il est nécessaire de les faire séjourner i)ondant 24 ou 48 heures.