CHAPITRE I BACTÉRIOLOGIE

Ce qu'il faut pour monter le laboratoire du praticien

Le laboratoire.

- Une chambre xîlaire, de préférence exposée au nord (pour

éviter le soleil) ;

- Deux tables : une table face à la fenêtre, assez grande, recou-

verte ou d'une toile cirée ou mieux d'une grande plaque de verre blanc ; l'autre, petite, dans un coin, doit porter Tétuve ;

- Un évier avec un robinet d'eau froide dans un coin ;

- Un placard en bois blanc pour les produits chimiques ;

- Une conduite de gaz à trois branches, deux aboutissant à

la table ; une pour un bec Auer de table, l'autre pour un bec Bunsen.

Si le gaz fait défaut, on peut au besoin se contenter d'une forte lampe à alcool ou d'une lampe à essence minérale (genre Pip), et d'un éclairage puissant (lampe à essence ou à alcool) ; la troisième branche s'arrête au voisinage de la plus petite table à étuve ; -Au dehors, dans la cour, quelques cages, le plus possible

métalliques, pour être facilement lavées. Le tout, bien abrité dans une baraque en planches : le chenil.

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Fig. 1. — Plan du laboratoire.

Le matériel.

- Sur la petite table, une étuve de Roux, de petite étendue, à réglage métallique ; la réunir à la conduite par un tube métallique souple. L'étuve contient un thermomètre, on alFume Tétuve, et avec la vis du régulateur on règle la température toutes les 4 ou 5 heures jusqu'au niveau régulier de Zf\

Lorsque le laboratoire n'est pas chauffé, il arrive que rétuve de Rpux se dérègle et ne puisse atteindre 87®. Il faut alors, ou avoir recours à un chauffage supplémentaire, ou disposer Tétuve dans un coin abrité. Le mieux est alors de choisir plutôt une étuve à eau, système Hearson. Le système Hearson est parfait et la grande masse d'eau empêche les trop rapides refroidissements. Suivant les cas,

on choisira une étuve à chauffage au gaz ou à la lampe

de pétrole.

A côté de la table : un four Pasteur et un petit autoclave

que Ton relie quand c'est nécessaire avec la conduite de

gaz de la table en enlevant le bec Bunsen ; Sur l'évier, un séchoir de bois et un centrifugeur hydrau-

Flacons pecouverU d'entonnoirs ^"^^^^ avec flltre

Platine chaulante

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Flacons eompte-gouHes SamedÊÙnia

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Flg. 2. — Plan de la table du laboratoire.

lique. On peut aussi utiliser comme centrifugeur, un centrifugeur à main adapté à la table, le modèle le plus puissant dans ce genre est le centrifugeur Jouan (Leune constructeur) ;

Un microscope monté sous son globe ou son cornet {voir plus loin) ; '

Des lames ordinaires (200) et deux boîtes de lamelles (de 22-22) ;

Un porte- tubes à essais de 10 places ;

Deux paniers à tubes en fil métallique ;

Deux cents tubes d'essfais, des tubes à pipette, 20 tubes à centrifugeur, un jeu de petits tubes à hémolyse ;

— Cinq verres à pied, 2 éprouvettes graduées : une à ao centi-

mètres cubes, l'autre à i5o ;

— Trois capsules de porcelaine de 200 centimètres cubes ;

— Cinq flacons de i litre (pour hémoculture) ;

— Cinq flacons compte-gouttes ;

— Deux pipettes graduées de 10 centimètres cubes et quatre de

I centimètre cube graduées au 1/20 (modèle Levaditi).

— Une pissette, que Ton peut monter soi-même avec un bouchon

à deux tubes ;

— Des flacons de i5o à 260 grammes, ordinaires pour réactifs ; - — Cinq, petits entonnoirs en verre qu'on laissera sur les flacons

des colorants avec leur filtre de papier ;

— Cinq entonnoirs plus volumineux (de 5o centimètres cubes

environ) ;

— Un trépied, un treillis de fil métallique ;

— Deux cristallisoirs d un litre ;

— Une platine chauffante ou une lame métallique bien plane

de 5 centimètres sur 26 centimètres et épaisse de 2 millimètres.

— Du papier filtre. Faire des filtres petits pour les petits enton-

noirs, grands pour les grands ;

— Deux fils de platine montés. On peut remplacer le platine

par des alliages métalliques dont le prix est moins élevée

Les produits *.

100 grammes d'acide acétique glacial ; 100 grammes d'acide phénique neigeux ; I® Réactifs : i litre d'acide azotique ;

— d'acide chlorhydrique ;

— de lessive de soude ;

— d'eau oxygénée, d'alcool absolu, d'alcool

à 90®, de xylol ;

— de formol à 4o p. 100 ;

i. Forcéiuenl, la description est incomplète. 11 faut se reporter plus loin et fixer ainsi le matériel et les produits nécessaires suivant que le praticien fera de la bactériologie, de l'hématologie, de la cytologie, de Turologie, do la coprologie, de la chimie, ou tout ensemble.

plus les réactifs désignés plus loin, se rapportant aux expériences que Ton doit faire.

a® Colorants : lo gr. de violet de gentiane ;

— de bleu de méthylène ;

— d'éosine ;

— de fuchsine ;

5 gr. d'iodure de potassium ;

— d'iode ;

I flacon de bleu polychrome et de l'éosinate de bleu de méthylène ; 10 gr. de benzidine ; plus les colorants désignés plus loin se rapportant aux expériences que Ton désire faire.

Lés animaux.

Cinq cobayes en cage commune ;

Dix sourb en petite cage à fin treillis et dans du coton.

Choix d'un miprospope

Une première question se pose :

Faut-il un microscope étranger ou un microscope français ? Pour le praticien et pour le savant, les microscopes français suffisent.

Leurs inconvénients : le fini du microscope est moins parfait,

les objectifs forts moins soignés.

Leurs avantages : leur prix est notamment moins élevé. . En général, ils suffisent. J'ai moi-même un microscope français depuis quinze ans et j'en suis toujours satisfait.

Pour le choix, il est nécessaire d'envisager successivement : le statif, les oculaires, les objectifs.

Le statif.

Le statif le* plus simple suffit. Comme pied, je conseille un trépied (modèle Pasteur). Inutile d'avoir un gros tube. Ghoi-

sissez le tube ordinaire avec articulation permettant Tinclinaison, avantage souvent impoiitant pour faciliter Téclairage.

Le statif portera un éclairage Abbe, un miroir à deux faces, et j'insiste sur ce dernier point, une platine mobile. Cette platine mobile sera de préférence le modèle Mal assez à grands mouvements. Les platines à mobilisation oblique ne suffisent pas (modèle Pasteur).

Le tube portera un revolver avec trois objectifs.

Les oculaires.

Inutile d'acheter plusieurs oculaires. Un seul suffit. Prenez-le à votre convenance et à votre œil. Faites- vous envoyer pour choisir, i, 2, 4 ou 6. Plus le chiffre est élevé, plus le grossissement est fort ; plus il est fort, plus il perd en netteté, plus il fatigue. Je vous conseille un « Oculaire compensateur 3 ».

Les objectifs.

Il faut trois objectifs :

Un objectif faible i ou 2.

Un objectif moyen 5 ou 6 pour l'hématologie et les agglutinations.

Un objectif à immersion au 1/12 pour la bactériologie.

L'objectif à immersion doit être choisi. Faites-vous envoyer des objectifs pour les choisir. Examinez une préparation type en ayant soin de recouvrir l'objectif d'une goutte d'huile de cèdre et en surveillant la mise au point. Le meilleur objectif se juge par la luminosité et par l'étendue du champ net sans modifier la mise au point. Les objectifs à immersion français sont quelquefois excellents, mais il faut les choisir. C'est là leur inconvénient. Les immersions étrangères sont excellentes, plus claires, mais aussi plus coûteuses.

Avec le microscope, demandez un globe et un feutre : le globe pour le couvrir, le feutre pour le poser.

Il faut encore une peau de chamois ou des linges fins usagés.

On peut se passer d'un globe, en le remplaçant par un grand

cornet de papier fort, collé, qui peut recouvrir complètement le microscope.

Un carré d'une couverture de laine peut facilement tenir lieu de feutre.

Soins du miorosoope

Ce qu'il faut :

I** Un globe ou un cornet de papier pour couvrir le microscope ;

2** Un feutre pour le poser de façon à Tempêcher de glisser ou une couverture de laine ;

3® Un flacon d'huile de cèdre que les fabricants livrent avec l'objectif à immersion ;

4* Une peau de chamois ou des linges fins usagés ;

5® Une table fixe sur laquelle on pose le microscope.

- Ce qu'il faut faire :

Monter tout d'abord lappareil. L'oculaire doit être en place et ne jamais être changé. Sur le revolver porte-objectif, on visse les deux ou trois objectifs que Ton possède et on les laisse indéfiniment en place. Seul l'objectif à immersion ne doit être vissé ^qu'avant l'usage. Il reste donc une place libre sur le revolver porte-objectif.

L'objectif à impDersion est déposé dans son étui à côté du microscope.

Le tout eet plftcé sur le feutre et recouveit du globe.

Quand le microscope est au repos il est bon que le revolver porte-objectif soit disposé de façon à ce que l'orifice libre corresponde à l'extrémité du tube du microscope. De cette façon on évite le contact des objectifs avec la lentille supérieure de l'éclairage, contact qui pourrait les briser.

Pour se servir des objectifs montés, il est facile de les diriger dans l'axe de vision par simple rotation du revolver.

Pour se servir de l'objectif à immersion, on commence par fixer sur la platine la préparation à examiner. On dévisse la boîte de l'objectif, on le retire avec précaution et on le dépose sur sa

base, lentille en Tair.^Avec la peau de chamois, on frotte légèrement la lentille et on dépose avec la petite spatule du flacon à l'huile de cèdre une goutte d'huile de cèdre sur la lentille de l'immersion. Montez ensuite votre immersion sur le revolver en évitant de la laisser tomber. Tournez le revolver de façon à amener l'immersion dans Taxe de vision et mettez au point.

Quand l'examen, est fini, on dévisse de nouveau l'objectif à immersion. On l'essuie avec la peau de chamois, toujours avec soin, et on le dépose dans sa petite boîte.

Ne laissez pas votre immersion sur le revolver. Cette habitude est déplorable. Une immersion est un objet de valeur, elle mérité que l'on en prenne soin. Si vpus la laissez en placé, il arrivera qu'un jour vous oublierez de l'essuyer. Vous ne rteûïarquez pas votre faute, car la lentille est en bas. Et le lendemain votre huile est sèche, collante. J'ai vu alors des étudiants prendre du xylol pour décrasser leur objectif et en user avec une telle abondance qu'ils décollaient les lentilles et perdaient leur immersion. Depuis plus de i5 ans, je me sers. d'une immersion qui est aussi claire que le premier jour, mais à la condition de la dévisser après chaque usage.

Si les objectifs se troublent, ne les essuyez qu'avec la peau de chamois. Si la souillure vient du Baume du Canada ou d'hUîle de cèdre, déposez une goutte de xylôl sur la peau et frottez légèrement et avec précaution.

Tous les 8 ou i5 jours, nettoyez tout TappareiJ avec la peau de chamois.

Ne laissez pas encrasser la platine, le xylol vous permettra de dissoudre l'huile de cèdre; ne conflez votre microscope à personne.

En somme, de la douceur et pas de négligence. Et attentibn aux domestiques ou aux garçons de laboratoire.

Comment mettre au point un miorosoope ?

Cette question a Taîr des plus simples. En réalité, c'est une des difficultés les plus décourageantes du débutant.

BACTERIOLOGIE y

Installation du microscope.

En général, pour mettre au point, il est nécessaire de commencer par bien placer son microscope. Il faut le placer en face d'une fenêtre bien éclairée. Il sera vertical ou légèrement incliné suivant la convenance du chercheur.

Ëclairage.

Le miroir est ensuite dirigé de façon à éclairer la préparation • à examiner. Il faut éviter que le microscope soit éclairé par les rayons solaires.

La nuit, je vous conseille d'employer l'éclairage au bec Auer ou dune lampe électrique . d'au moins 3o bougies avec interposition entre la lampe et le miroir d'un ballon d'un litre rempli d'eau distillée faiblement teintée en bleu par une trace de sulfate de cuivre. Avec un petit écran de carton fixé au goulot du flacon, vous éviterez de recevoir les rayons dans les yeux.

Le ballon, sera placé près de l'éclairage et le microscope à environ 5o centimètres du ballon ;• il sera facile de fixer cette distance suivant l'intensité de l'éclairage obtenu.

Pour le début de l'examen supprimez l'éclairage Abbe en l'abaissant et en le tournant en dehors et n'utilisez pas de diaphragme.

La préparation a été fixée sur la platine et disposée à l'aide des vis directrices de façon que la région à examina corresponde à l'axe du microscope.

Fijç. 3. — Microscope.

Mise au point avec un objectif faible (examen de matières, urines, etc.).

Pas d'éclairage Abbe, pas de diaphragme. Miroir concave.

Mettre Tobjectif dans le rayon de vision. Abaisser le tube avec la grosse vis jusqu'à ce que Tobjectif vienne presque en contact avec la préparation en surveillant ce -mouvement.

La mise au point se fera en remontant, Tœil au microscope. On remonte avec la grosse vis et lentement. Quand la mise au point est obtenue, on peut la compléter à la vis micrométrique.

En général, je conseille de ne pas mettre au point en abaissant ; il peut arriver que l'on passe le point et que l'objectif vienne buter contre la préparation, d'où il peut résulter que la préparation ou l'objectif éclatent sous la pression.

Mise au point avec un objectif moyen (6 à 8) (numération du sang, séro-diagnostic typhîque).

On procédera de la môme façon. Abaisser l'objectif jusqu'à contact avec l'objet et faire la mise au point en remontant, maïs à la vis micrométrique.

Pour la mimération du sang, attention de ne pas enfoncer la lamelle de l'hématimètre. Il faut savoir que cette lamelle est souvent d une épaisseur telle que la mise au point est impossible avec un 8, d'où la nécessité de recourir à un objectif plus faible, de préférence un 6. •

Pour le séro-diagnostic y on peut employer l'éclairage Abbe, mais à la condition de le diaphragmer fortement ou de l'abaisser de 3 à 4 millimètres. La préparation doit être éclairée en gris et non en grande lumière. C'est la condition essentielle pour bien voir les bacilles. On met au point en remontant, en cherchant comme point de mire des globules rouges ou des bulles d'air. Recommencer avec patience ; il est souvent difficile d'arriver à mettre au point.

Il faut tenir compte de plusieurs obstacles : il ne faut pas que l'objectif soit mouillé par la culture, il faut que la lamelle soit bien au-dessus de la lame et non au-dessous comme certains débutants le font quelquefois.

Mise au point avec un objectif à immersion (hématologie, bactériologie).

Mettre bien la lame de façon que le dépôt à examiner soit audessus, ne pas se tromper de face.

Placer Téclairage Abbe sans diaphragme de façon à obtenir la plus grande luminosité. Miroir plan.

Visser l'immersion, la braquer sur l'objet, rabaisser de façon que Thuile de cèdre que Ton a déposée au préalable sur la lentille vienne en contact de la lame, obtenir lentement avec la grosse vis le contact entre la lame et Tobjectif. Mettre au point en remontant à la vis micrométrique. Pas de violence, pas d'énervement, de la douceur et de la patience. Quand on obtient la mise au point, compléter l'éclairage en dirigeant le miroir plan et en le tournant jusqu'à convenance.

Il peut arriver que l'on ne puisse pas mettre au point. Il faut / alors s'assurer que la lame est bien en place. L'huile peut avoir été déposée sur le mauvais côté de la lame. On retire la lame et on s'assure que c'est bien sur son côté mat qu'a été déposée l'huile de cèdre.

Lorsque l'examen est fini, relever le tube avec la grosse vis, essuyer les objectifs, enlever l'objet.

Comment faire du bouillon de oulture 7

I® Des tubes à essais stérilisés à l'autoclave, à 120** en l'absence de four Pasteur ;

2® Un flacon d'extrait de viande Liebig ou de la peptone Chapoteaut ;

3® Une solution de soude diluée ;

4** Du papier de tournesol, du papier filtre ;

5** Des ballons et entonnoirs.

Ce qu'il faut faire :

a) Bouillon à Vextrait de viande :

I** On dissout à feu doux 5 grammes d'extrait de viande Liebig dans i.ooo centimètres cubes d'eau ; laisser refroidir ;

a** Éprouver sur papier de tournesol. Si le milieu est acide, TalcaUniser légèrement en ajoutant une ou quelques gouttes de

soude diluée. Filtrer sur un ballon ;

3® Chauffer dans un ballon, à II 5", à rautoclave ;

4® Filtrer à chaud sur un filtre mouillé ;

5® Répartir dans les tubes stériles ;

6** Stériliser les tubes à lautoclave, à ii5®, pendant trente minutes.

b) Bouillon au poisson. — Etant donné le prix de la viande, on vient de conseiller remploi des milieux au poisson. On découpe 5oo grammes de chair de merlan pour I litre d'eau ; cuisson 20 minutes. Filtrer sur papier, stériliser à 120® pendant ao minutes, le milieu est neutre au tournesol.

c) Bouillon à la pepfone.

Milieu T :

I® Dissoudre à feu doux, I litre d'eau distillée, 5 grammes de sel,

. Fig. 4 . — Autoclave.

dans Ao grammes de peptone Chapoteaut, 2 grammes de glucose pur.

2* Alcaliniser fortement à la soude diluée en éprouvant au papier de tournesol ;

3* Filtrer, répartir dans des tubes stériles ;

4® Stériliser les tubes à Tautoclave, à iiB**, pendant trente minutes.

Comment préparer une gélose 7

I* 'Du bouillpn stérile à la viande, au poisson, au Liebig ou à la peptone ;

2*. Dé l'agar-agar coupé en petils brins et lavé pendant une heure dans l'eau froide.

Ce qu'il faut faire :

1° Ajouter au bouillon 2 ou 3 p. lod d'agar-agàr ;

2" Faire fondre à la chaleur en agitant le mélange avec un agitateur ;

3® Alcalinîser ;

Ix^ Filtrer à chaud dans l'autoclave ouvert, mais recouvert de son couvercle, ou mieux dans un entonnoir spécial. Cette fîltration n'est pas toujours nécessaire. Dans la préparation de la gélose T, on ne filtre pas et on emploie le milieu liquide T (p. i7).

5® Stériliser en ballon à 11 5® à l'autoclave. Répartir rapidement en tubes avec un large entonnoir muni d'un tube de caoutchouc qu'on écrase avec une pînce pour le fermer. Pour le milieu T à gélose non filtrée, on laisse les flocons les plus volumineux se déposer au fond du tube avant de l'incliner.

Comment préparer l'albumine d'œuf è la soude ?

Pour enrichir les milieux, on préconise l'adjonction d'ascite ou d'albumine d'œuf à la soude. La préparation de cette albunaine est des plus simples.

1° Dissoudre 2 blancs d'œufs à 5o" dans 200 centimètres cubes d'eau distillée ;

a® Agiter constamment en évitant la mousse ;

3® Ajouter i centimètre cube de soude à 10 p. 100 ;

4' Bépartîr en tubes et stériliser à uo"-u5* pendant 20 minutes.

Comment préparer une gélose riohe ?

Ce qu'il faut :

1° Des tubes contenant 6 centimètres cubes de gélose à 3 p. loo stérilisée, gélose ordinaire ou gélose T ;

2** De l'ascile stérile, conservée en ampoules scellées à la lampe (on peut se procurer dans le commerce des ampoules d'ascite), ou de l'albumine d'œuf à la soude conservée en tubes stériles ou en ampoules ;

3** Une pipette de 2 centimètres cubes stérile ;

Ix^ Des boîtes de Pétri stériles.

Ce qu'il ,faut faire :

I® Faire fondre au bain-marie les tubes de gélose ;

2° Après liquéfaction complète, laisser refroidir vers 45®. Ajouter alors à chaque tube a centimètres cubes d'ascite ou d'albumine d œuf à la soude. Mélanger en agitant et couler immédiatement en boîte de Pétri.

Pour préparer les géloses ascites sucrées et tournesolées, incorporer dès la liquéfaction complète de la gélose, les solutions sucrées et la teinture de tournesol. Laisser refroidir à 45®. Opérer ensuite comme pour la gélose ascite simple.

Pour la culture du méningocoque et du gonocoque, les géloses à Tascitc sont préférables aux géloses albumineuses.

Stériliser au four Pasteur ou au four de ouisine

Dans la chaleur sèche un séjour de 3o minutes à 170® suffit à détruire tous les germes.

Au FOUR PASTEUR.

Ce qu'il faut :

I® Un four Pasteur ;

2® Le gaz, de préférence aux lampes à pétrole (genre Ultimus) ; 3® Les objets à stériliser : objets de verrerie (pipettes.,, tubçs^ fioles, boîtes de Pétri, etc.) ;

BACTERIOLOGIE

Objets de porcelaine ; .

Filtres, instruments.

Les tube», flacons, fioles, pipettes sont bouchés au coton ordinaire. Déposer le coton sur Torifice, le pousser avec une pointe

Fig. 5. — Grwde étuve de J^oux,

mousse (crayon). Le bouchon doit être, peu serré et plonger de a à 4 ceatimètres dans le récipient.

Les boîtes, verres, cristallîsoirs sont enveloppés ou recouverts de papier-filtre.

Ce qu'il faut faire :

i^ Mettre dans le panier les objets à stériliser, préalablement séchés avec soin ; introduire le panier dans le four ; 2® Placer le couvercle, enfoncer le thermomètre ; 3** Allumer le gaz au contact même du bec au moment où Ton ouvre le robinet pour éviter toute explosion ;

4® Chauffer doucement ; à 170**, baisser la rampe en veilleuse,

maintenir à cette température, éteindre après 3o minutes ;

5® Ne jamais abandonner l'appareil en fonctionnement ;

6® N'enlever le couvercle qu'après refroidissement, retirer avec soin les objets en les déposant sur un journal.

On peut utiliser, à défaut de four Pasteur, le stérilisateur Lequcux, qui, étant de I etit volume, ne permet que la stérilisation du petit matériel (pipettes, aiguilles, seringues). Il est formé d'une boîte en cuivre à double paroi chauffée par deux lampes à alcool. On pousse le chauffage à la même température que pour le four Pasteur.

Au FOUR DE CUISINE.

On peut stériliser aussi d'une façon plus pratique pour le médecin de campagne, il suffit d'un fourneau de cuisine. Les

Fig. 6. — Etuvo électrique.

objets à stériliser sont disposés dans des paniers métalliques sans soudures que Ton dépose sur une série de briques appliquées elles-mêmes sur la paroi inférieure du four à cuire du fourneau. On recouvre les objets avec une feuille de coton cardé, sans toucher les parois du four. Chauffer porte fermée. On saura que la température de stérilisation sera obtenue quand le coton cardé jaunit légèrement. Retirer alors les objets eii les déposant sur un journal pour qu'ils refroidissent. Il arrive au début que certains cotons brûlent, un peu d'habitude suffît.

iStérilisation à Tautoclave

Elle est basée sur le principe suivant : dans ane atmosphère de vapeur d'eaa, exempte d'air, tous les germes sont tués par exposition pendant 20 minutes à une température de ii5®.

Elle est indiquée :

Pour ]a stérilisation des milieux de culture, sauf le sérum coagulé ;

Pour la stérilisation des seringues destinées aux prélèvements ou aux injections ;

Pour la stérilisation des récipients bouchés au coton ;

Pour la stérilisation des cultures bactériennes à jeter.

Ce qu'il faut :

1® Un autoclave Chamberland, le petit modèle suffit (fig. 4) ; .2** Une source de chaleur (gaz ou lampe Prîmus ou Ultimus) ;

3^** Les objets à stériliser bouchés au coton et recouverts de papier ou d'une compresse épaisse pour éviter la condensation de l'eau. Les objets non bouchés au coton sont enveloppés dans du papier. Ces objets sont disposés sur le panier de l'autoclave, ouverture en haut, en évitant de mettre les orifices au contact des parois latérales oiîi l'eau se condense.

Ce qu'il faut faire :

I® Verser dans la chaudière de l'eau en quantité suffisante pour atteindre un peu au-dessous du fond du panier vide ;

2** Introduire dans la chaudière le panier chargé ; 3® Poser la rondelle de caoutchouc et sur elle le couvercle que l'on fixe en serrant fortement les écrous deux à deux (en même temps lès écrous de chaque côté d'un même diamètre) à la main ; éviter le serrage à la clef ;

4° Ouvrir le robinet d'échappement. Allumer le gaz en évitant de laisser le robinet de gaz ouvert avant d'approcher l'allumette, de façon à ne pas avoir d'explosion. Chauffer doucement ; 5° Surveiller le robinet. Au début, la vapeur s'échappe en jet

discontinu, entrecoupé d'espaces clairs ;

quand le jet est continu, on ferme le robinet ;

6** Ne pas perdre des yeux le manomètre. Quand l'aiguille est arrivée à iiô", baisser la flamme en fermant le robinet de façon à maintenir la température de 110** ; avec les lampes Ultimus, on déplace la lampe sur le côté et on l'éloigné ou la rapproche suivant que la température s'élève ou s'abaisse ;

7® On doit maintenir 20 minutes à 11 5°.

Ce temps écoulé, on éteint le chauffage ; 8** Quand l'aiguille du manomètre est descendue au zéro, et seulement à ce moment, ouvrir le robinet du couvercle pour laisser échapper la vapeur, dévisser les boulons, enlever le couvercle, retirer le panier ; pour éviter de les refroidir trop vite, déposer les objets sur un journal déplié ;

9° Si les bouchons sont mouillés, porter quelques heures à l'étuve pour les sécher.

Maniàre pratique de préparer du sérum coagulé pour cultures d'angine

On peut, dans un petit laboratoire, préparer soi-même son sérum coagulé. On en fait une cinquantaine ou une centaine de tubes, suivant les besoins.

Fig. 6. — Four Pasteur.

Ce qu'il faut :

i** Un ou deux bocaux de i à 2 litres bouches avec un coton stérilisé a 120** ;

2° Des tubes à essais stérilisés à sec à 170® (four Pasteur) pendant 3o minutes, ou à chaleur humide à iSo** pendant 20 minutes ;

3® Une pipette à boule ou une pipette de 10 centimètres cubes stérile ;

4° Un couvercle métallique de boîte de biscuits et du sable fin.

Ce qu'il faut faire :

I** Recueillir le sang à labattoir. On y part avec le où les bocaux stériles. Durant la saignée du bœuf, on laisse échapper les premiers jets de sang, puis on recueille le sang qui vient ensuite dans le ou les deux bocaux. Recouvrir les bocaux. Les laisser à Tabattoir pour la rétraction dans un coin frais de l'appartement du concierge pendant 24 heures ;

2® Le lendemain, le sang est apporté au laboratoire. Avec un fil de platine flambé, on décolle le caillot, on ferme et on incline le récipient de façon à obtenir une décantation de 24 à 48 heures ;

3** Après ce temps, on aspire le sérum surnageant à la pipette stérile et on le répartit dans les tubes à essais stériles, à raison à peu près de 4 centimètres cubes par tube. Les tubes sont fermés au coton stérile et capuchonnés de papier ;

4** Préparer l'appareil à coaguler. Déposer sur un feu doux une marmite contenant de l'eau et, sur cette marmite, déposer le couvercle de la boîte de biscuits par sa face externe. On remplit le plan à rebords (face interne) avec le sable fin. Porter l'eau à l'ébuUition et la maintenir â Tébullition ;

5® Déposer les tubes de sérum dans le sable, en leur donnant l'inclinaison suffisante, les recouvrir ensuite d'une légère couche de sable ; les tubes doivent ne pas toucher les bords du couvercle ;

6** Quand l'appareil est chaud, les tubes coagulent en une denii-heure. On s'en aperçoit quand la colonne de sérum solidifié est parfaitement compacte en position verticale. Si la prise n'est

^0 DIAGNOSTICS BlOLOaiQUES EN CLIENTÈLE

pas faite, remettre le tube en place, le surveiller tous les 5 minutes ;

7® Quand le sérum est solidifié, laisser refroidit*. Le sérum doit être demi-transparent et très légèrement ambré. On les capuchonne ou non de papier et on les porte 24 heures à 87® pour vérifier s'ils sont aseptiques ;

8® Une provision peut être conservée k mois et plus.

La stérilisation des seringues

11 n'est pas dé question plus importante pour le médecin et pour' le bactériologiste. Si on veut faire des prélèvements à la seringue d'une façon rigoureusement aseptique, tels" par exemple que des hémocultures, il faut un matériel à Tabri de tout« infection secondaire, la stérilisation est nécessaire. L'ébullition ne suffit pas et expose aux plus grossières erreurs par la fréquence des contaminations extérieures. Lorsque le praticien sera habitué à cette technique de stérilisation constante, il la généralisera en l'appliquant au matériel d'urgence. Nous ne nous occuperons que des seringues et des aiguilles.

Ce qu'il faut :

i^ Gomme seringues, il n y a pas à hésiter, on ne doit employer que des seringued en verre. La seringue de Roux à piston en amiante a l'inconvénient de s'abîmer rapidement par les stérilisations successives et de perdre ainsi son étanchéité. En pratique il faut :

Une seringue de 20 centimètres cubes pour les prises veineuses nécessaires au dosage de l'urée sanguine ;

Plusieurs seringues de 10 ou 5 centimètres cubes pour hémocultures, réaction de Wassermann, injections intraveineuses, ponctions exploratrices ;

Plusieurs seringues de ^ 2 centimètres cubes pour petits prélèvements ou petites injections.

2® Les aiguilles seront de préférence en platine. Mais si l'acier n'est pas assez résistant aux stérilisations successives, le nickel ou

BJICTÉRIOLOGIE 21

les alliages seront d un excellent usage. On prépare actuellement des! aiguilles résistantes et pas chères. Il faut :

Une aiguille à ponction lombaire, le genre Tuffîer suffît pour la pratique ;

Une aiguille courte et de gros calibre pour les saignées veineuses ;

Plusieurs aiguilles moyennes de a à 5 centimètres de long. 3* Ce matériel doit être stérilisé tout monté, c'est-à-dire l'aiguille adaptée à sa seringue. Il faut donc rengainer pour la stérilisation. La meilleure gaine est un tube de verre dans lequel plonge la seringue entièrement. Les tubes varient suivant l'importance de la seringue : Gros tube de 4>5 sur 26 pour la stérilisation des seringues de 20 centimètres cubes, de 3 sur i5 pour la stérilisation des petites seringues. Nous conseillons les tubes ordinaires régulièrement calibrés. On a utilisé des tubes effilés de façon à empêcher la seringue de trop appuyer sur la pointe de l'aiguille. Ils ont l'inconvénient d'être fragiles au nettoyage et au chauffage. Les aiguilles isolées comme les aiguilles à ponction lombaire seront stérilisées dans des tubes à essais ordinaires ou de petits calibres.

4* Pour empêcher les aiguilles montées de porter sur leurs pointes, on peut les introduire dans un petit verre à pipette coupé à la longueur suffisante pour empêcher le contact de la pointe de l'aiguille avec le fond du tube.

. Là technique est différente suivant le mode de stérilisation.

Stérilisation à Vautoclave Stérilisation au four Pasteur

Avantages :

Permet de vaseliner les serin- Evite l'humidité qui rouille les gués et les rend ainsi plus aiguilles d'acier et altère les

étanches embouts.

Inconvénients : Peut faire casser les seringues

, . . . . , si les pistons sont humides.

Laisse persister une certaine , . . .

, . ,. , , , , ' Les seringues sont moins

humidité dans les tubes. .^ , ^ ^ , .

étanches et peuvent laisser

passer de l'air entre le piston et^ le corps de la seringue.

Technique : Dans les deux cas, la seringue et laiguille contenant son mandrin doivent être très propres et ne porter aucune souillure de sang ou de substance albuminoïde quelconque.

Bien sécher séparément le piston, la seringue et Taiguille.

On monte la seringue de la même façon et 9i on utilise le tube à pipette protègepointe, ce tube est vaseline en dedans.

Vaseliner le corps de piston, l'embout et Taiguille. La seringue est introduite toute montée dans le tube, dont le . fond est occupé par un gros tampon de coton bien tassé recouvert d'une feuille de papier-filtre plié en quatre. L'aiguille contient son mandrin qui ressort par sa pointe en se coudant.

La seringue appuie sur sa pointe pour que, dans l'ouverture du tube, ce soit l'extrémité du piston qui tombe dans la main. On ferme ensuite le tube avec un fort bouchon de coton.

Stérilisation 30 minutes à 170'

Stérilisation 20 minutes à il5°.

Les instruments, à la sortie de Tautoclave, seront séchés à l'étuve ou mieux près d'une source de chaleur.

Les tubes ne sont ouverts qu'au moment de l'emploi. Ils peuvent se conserver plusieurs mois stériles à la condition d'être en milieu sec.

Comment reoueillir du pus peur Texemen baetérielegique

Ce qu'il faut :

I** Des tubes pour pipette fermés aux deux bouts par de louate et stérilisés au four Pasteur i.

Au moment de l'emploi, étirer une pipette : porter la partie moyenne du tube à pipette dans une flamme bleue (Bunsen, dialuméau, forte lampe à alcool), le maintenir dans la flamme en tournant, de façon à chauffer uniformément toutes les faces du tube jusqu'à ce que le verre devienne rouge et se ramollisse. Alors, retirer brusquement le tube de la flamme et, en exerçant une traction régulière sur les deux extrémités de la pipette, étirer le verre en dehors de la flamme. Reporter ensuite dans la .flamme, pour séparer au milieu la portion effilée et fermer chaque extrémité effilée des deux pipettes. Les pipettes sont livrées toutes faites d^ns le commerce, mais avec un peu d'habitude il est facile de les étirer avant l'emploi, ce qui évite les cassures des extrénytés. Toute pipette cassée accidentellement avant l'emploi doit être considérée comme souillée.

2® Un tube à essai bouché au coton et stérilisé au four Pasteur.

3® Une seringue en verre et son aiguille en platine.

Pour la stériliser, la faire bouillir une demi-heure dans de l'eau faiblement salée, la monter et la faire bouillir de nouveau toute montée. La retirer de l'eau en évitant d'aspirer de l'air ;

4® Un verre de montre ayant bouilli pendant le même temps.

i" Aseptiser la peau. Lavage au savon, à l'éther, badigeonnage à la teinture d'iode. Asepsie des mains de l'opérateur ;

2® Flamber l'aiguille montée sur la seringue dans une flamnie bleue jusqu'au rouge sombre ;

1. Le matériel de verrerie peut être expédié tout stérilisé par les pharmaciens spécialisés (Carrion, par exemple), ou par les fournisseurs de laboratoire (Gogit, Fontaine, etc.).

3® Ponctionner en évitant toute souillure de Taiguille (doigts), et aspirer en évitant soigneusement les bulles d'air ;

4^ Retirer la seringue, et ou bien la vider dans un tube à essai ou bien procéder à la mise en pipette. Ce dernier procédé sera employé si le pus doit être expédié par la poste.

a) Pour la vider dans le tube à essai, flamber rapidement l'embout de la seringue. Déboucher le tube maintenu dans la main gauche en pinçant le coton par flexion du petit doigt de la main droite, flamber l'ouverture du tube qui est maintenu fortement incliné, évacuer la seringue dan3 le tube. Reflamber l'ouverture du tube et boucher avec le même coton, qui a été toujours maintenu par le petit doigt de la main gauche durant le débouchage.

b) Pour remplir la pipette, vider la seringue da^s le verre de montre, casser Teffilure de la pipette, la flamber, la plonger dans le pus, et aspirer par le gros bout de la pipette sans la déboucher ; il faut se garder d'en aspirer beaucoup, de façon à ne pas souiller le coton de la pipette ; quelques gouttes suffisent. Fermer la pipette en portant dans la flamme bleue la partie moyenne de Teffîlure et en étirant l'extrémité fine en pleine flamme.

Pour emballer la pipetie chargée, il est nécessaire de l'introduire dans un tube à essai dont le fond est garni de coton. Il faut donc une pipette courte, à effîlure courte ; on veillera aussi à fermer la pipette assez près de son collet d'étirement, car les fines effîlures se cassent en voyage. Toute pipette cassée à l'arrivée doit être considérée comme souillée.

Examen morphologique et bactériologique du pus

Ce qu'il faut :

I® Le pus recueilli aseptiquement en tube ou en pip^ette ; 2** Des lames 1 ;

Pour nettoyer les lames et les lamelles sales, on les jette au fur et à mesure des manipulations dans un récipient contenant

1. Le matériel de verrerie se trouve chez tous les fournisseurs de laboratoires (Gogit, Fontaine), et dans les verreries de laboratoire (Leune).

de Talcoôl dénaturé, on les égoutte et on les place ensuite dans une terrine qui renferme une solution de carbonate de soude (cristaux) à 2 p. 100 ; faire bouillir 3o minutes ;

Après refroidissement laver à Teau propre et faire bouillir 3o minutes dans une solution à 3 p. 100 d'acide chlorhydrique du commerce ;

Laver à l'eau propre, égoutter, essuyer et conserver à labri des poussières.

3® Un fil de platine monté ;

4* Un microscope avec une immersion à huile 1/12 ;

5^ Des colorants. Un bleu basique (bleu de méthylène, bleu de tohwdmc^ bku polychrome).

Du violet de gentiane ;

( Iode 1 gramme

De la solution de Gram ] lod. de potassium. . 2 — (Eau 200 —

De réosine ou de la fuchsine de Ziehl diluée au i/io.

Toutes les solutions colorantes se trouvent toutes faites dans le commerce, on peut les préparer soi-même. Les colorants seront demftndés^è l'état solide i. Chaque solution est aqueuse à i p. 100, il est nécessaire de phéniquer le violet de gentiane et le bleu de méthylène à la dose de o,5 à i p. 100.

Violet de gentiane ...... 1 gramme.

Acide phénique neigeux ... 2 —

Alcool absolu 10 centimètres cubes.

Eau distillée 100 —

Triturer dans un mortier le violet et Palcool, ajouter l'acide phénique, triturer ; ajouter petit à petit les deux tiers d'eau en mélangeant ; Verser dans un flacon, rincer le mortier avec le dernier tiers d'eau, verser l'eau du rinçage dans le môme flacon. Attendre 24 heures, filtrer, recueillir en flacon bouché à l'émeri pour provision.

Les colorants seront ^conservé s sur la table en flacon comptegouttes, ou en petit flacon ordinaire ; un petit entonnoir et un filtre permettant la filtration extemporanée.

1. A demander au pharmacien, droguiste, ou fournisseur de laboratoires.

Ce qu'il faut faire :

I® Flamber le fil de platine au rouge, après lui avoir recourbé en anse Textrémité J

2® Recueillir avec le fil une gouttelette de pus dans le tube à essai ou à Torifice de la pipette cassée et vidée ;

3° Etaler ]a gouttelette avec le fil de platine sur plusieurs lames ;

4° Sécher les lames ;

5® Les fixer en les passant trois fois dans une flamme bleue ;

6** Les colorer :

L'une avec un bleu.

L'autre avec lin Gram.

a) Avec un bleu. Bleu de méthylène par exemple. Verser du bleu filtré sur la lame ;

Laisser 5 minutes ; Laver à Teau de fontaine ; Sécher en agitant la lame.

b) Avec le Gram.

Verser sur la lame du violet de gentiane phéniqué ;

Laisser 5 minutes ;

Verser sur la lame, sans laver, la solution de Gram, 2 à 5* minutes ;

Laver à l'eau ;

Laver à l'alcool à 90® ou dénaturé pendant i minute jusqu'à ce que l'alcool ne se colore plus en violet ;

Laver à l'eau ;

Colorer à Téosine ou à la fuchsine diluée 2 minutes, laver à l'eau. Sécher,

7® Les examiner :

Déposer de l'huile de cèdre sur la lame colorée et séchée, ne pas se tromper de face ;

Monter sur le microscope l'objectif à immersion 1/12 ;

Mettre prudemment au point.

L'examen portera sur les éléments cellulaires et sur les microbes.

Les éléments cellulaires sont des polynucléaires, des lymphocytes, des macrophages des cellules cancéreuses, des globules rouges ; on les étudie sur la préparation colorée au bleu. Lés noyaux sont fortement colorés.

Les éléments microbiens sur les lames au bleu sont étudiés dans leur morphologie sur les lames au Gram dans leurs affinités. Les microbes vus au violet noir sur ces préparations ont pris le Gram ; les autres sont colorés en rose ou en rouge, ils n*ont pas pris le Gram.