PRENNENT LE GRAM : NE PRENNENT PAS LE GRAM
Staphylocoque. Gonocoque.
Streptocoque. ' Méningocoque.
Entérocoque. Bacille typhîque.
Pneumocoque. Bacilles paratyphiques.
Bacille diphtérique. *• Coli-bacille.
Bactérie charbonneuse. Bacille de la peste.
Vibrion septique. Bacille dysentérique.
Tétanos, etc. Vibrion cholérique, etc.
Ce qu'il faut voir et ce qu'il faut dire :
a) COCCI ARRONDIS. '
Petits grains en courtes chaînettes, prenant le Gram = streptocoques ou entérocoques.
Petits grains groupés en petites grappes, prenant le Gram = staphylocoques.
Petits grains plus gros, groupés par quatre, prenant le Gram = tétragènes.
h) DiPLOCOQUES. — ' Les diplocoques sont des cocci groupés par deux.
I® Deux petits grains de café se regardant par leur face plane, répartis le plus souvent dans un polynucléaire, ne prenant pas le Gram = gonocoques ou méningocoques. Pratiquement, la distinction se fait par Torigine du pus ; pour une distinction
ié
jM
Fig. 8. — Pneumocoques dans les crachats de pneumonie Colorât, à la thionine phéniquée. Les pneumocoques apparaissent entre trois leucocytes polynucléaires sous la forme de diplocoques, lancéolés, en flamme de bougie et encapsulés.
Fig. 9. — Gonocoques dans un pus uréthral.
Le gonocoque est parfois extracellulaire, mais sa situation caractéristique est à l'intérieur d'un polynucléaire. Il se voit dans cette préparation avec son aspect caractéristique de deux grains réniformes se regardant par leur face concave.
plus complète, envoyer un tube de culture sur gélose ascite dans un laboratoire central.
2** Deux petites flammes de bougie se regardant par leur extrémité. Le plus souvent, extracellulaires. Preijant le ,Gram et encapsulés = pneumocoques,
à) Bacilles.
I** Bacille de moyenne longueur aux extrémités arrondies, — Surtout extracellulaîre mobile, entre lame et lamelle, ne prend
Fig. IQ. — Tétragènes. Cocci en tétrades.
pas le Gram, peut-être surtout bacille d*Eberih ou coli-biacille. Pour les différencier faire une culture sur bouillon.
Si bacille immobile, ne prenant pas le Gram = bacille dysentérique,
2° CoccO'bacillCy tenant le milieu entre la forme arrondie des cocci et l'aspect alloTigé des bacilles.
— Encapsulé, en courtes chaînettes, ne prend pas le Gram = pneumo'bacille de Friedlander. ^""
Très grêle, très petit, mal coloré, ne prend pas le Gram = coccO'bacille dé Pfeiff^r.
Bacille court et fin dont le centre se colore moins que les extrémités, disposé en chaînettes provenant d'un chancre douteux, ne prend pas le Gram = bacille de Ducrey.
3® Bacille long. — Bacille en clou, long, grêle, avec une spore claire, prend le Gram chez un tétanique = bacille tétanique.
Gros bâtonnet à bouts carrés, prend le Gram, découvert dans une plaie douteuse avec gros œdème = bactéridie charbonneuse.
Bâtonnet, à bouts à peine arrondis, volumineux, encapsulé et
Fig. 11. — Streptocoques en culture sur bouillon.
immobile, prend le Gram non sponilé dans un exsudât de plaie mortifiée = bac, perfringens.
Bâtonnet immobile, enchevêtré en broussaille, prend le Gram, dans un exsudât membraneux de la gorge = bacille diphtérique.
d) Microbes associés.
Souvent, dans une suppuration, on constate la présence de plusieurs espèces microbiennes : c'est le cas surtout pour les suppurations qui avoisinent le tube digestif. L'attention doit porter sur chaque élément.
Si le pus est fétide, si les éléments microbiens sont très variés dans leur forme, peu colorables et très nombreux, c'est
que la suppuration contient probablement des anaérohies. Dans ces cas, la culture sur gélose inclinée ou sur gélose profonde est nécessaire.
Fig. 12. — Bacillus perfringens.
Fréquent dans les frottis des plaies de guerre.
Fig. 13. — Bacilles du tétanos.
Forme de clou. Spore ronde. 11 est simulé par des espèces non pathogènes. Lî façon certaine de le reconnaître est de recourir à l'inoculation de l'animal.
D'ailleurs, pour plus de certitude, il est nécessaire d'ensemencer
Fig. 14. — Bacille du chancre mou.
Bacille de Ducrey : bacille assez court à extrémités arrondies qui se dispose en chaînettes ou en amas plus ou moins volumineux. Ce frottis est celui d'un chancre mou, il contient en plus quelques leucocytes du pus.
Fig. 15. — Bactéridie charbonneuse.
Ce sont de grands bâtonnets rectilignes à extrémités coupées net. Elle se colore par le Gram.
tout pus examiné. L'examen morphologique n'est pas suffisant pour autoriser un diagnostic définitif,
A plus forte raison, si l'examen morphologique ne fournit aucun renseignement, il faut recourir à la culture sur gélose, et souvent même à l'inoculation au cobaye, car les suppurations tuberculeuses sont le plus souvent morphologiquement amîcrobiennes.
Méthode de Claudius pour la différenoiation miorobienne
La méthode de Claudius est analogue à la méthode de Gram. Elle sert aussi pour reconnaître certaines espèces microbiennes. On peut dire cependant qiie les microbes qui restent colorés par le Gram gardent aussi le Claudius. Cependant, la méthode de Claudius convient mieux pour la différenciation du vibrion septique, du bacille de la diphtérie et d'autres microbes qui ne prennent pas toujours bien nettement le Gram.
Ce qu'il faut :
i^ Des lames couvertes du frottis microbien, fixées à la chaleur ;
2* Une solution de violet de gentiane pbéniqué ;
Solution saturée de violet de gentiane dans
l'alcool à 95' 10 centimètres cubes.
Eau phénîquée à 1. p. 100 100 — —
ou une solution de violet.de méthyle & 1 p. 100.
3® Une solution d'acîde picrîque ;
Solution saturée d'acide picrique ** ââ 1 vol
Eau distillée ^
4' De l'eau distillée ;
5® Du chloroforme ou de l'essence de girofle ; 6® Un microscope monté : éclairage Abbe et immersion homogène ;
7* Du baume du Canada et des lamelles.
Ce qu'il failt fair:; :
I** Colorer une minute au violet de gentiane ou de méthyle ;
2® Lavage à l'eau distillée ;
3® Pendant une minute faire agir la solution d'acide picrique ;
4* Lavage. Enlever l'excès au papier filtre ;
5** Décolorer au chloroforme ou à l'essence de girofle, jusqu'à ce que le réactif ne se teinte plus en bleu ; . 6** Monter sous lamelle au Baume du Canada ;
7** Examiner à l'immersion homogène.
Ce qu'il faut voir :
gardent le claudius ne le gardent pas *
(restent violets) (se décolorent)
Staphylocoque. Bacille typhîque.
Pneumocoque. Coli-bacîlle.
Bacille diphtérique. Vibrion cholérique.
Bactéridie charbonneuse. Pneumobacille.
Tétragène. Pyocyanique.
Bacille tétanique. Gonocoque.
Bacille de la lèpre. Méningocoque.
Bacille tuberculeux.
Vibrion sep tique.
Cette méthode est aussi applicable aux coupes. Elle peut en somme aider à la différenciation microbienne . et remplacer la méthode de Gram dont le principe est sensiblement le même, la liqueur lodo-îodurée remplaçant la solution picrique de Claudius.
Examen microscopique des sécrétions des plaies de guerre dans la méthode de Carrei
Carrel préconise l'examen microscopique des sécrétions des plaies ;
Pour se rendre compte du degré d'infection des plaies ;
Pour suivre les progrès de la désinfection ;
Pour confirmer les symptômes cliniques et rendre possible la détermination du moment où l'on peut procéder à la fermeture chirurgicale des plaies ;
Pour la technique telle que la conseille le D' Vincent dcB troupes coloniales, chef de laboratoire du D' Carrel.
Ce qu'il faut :
I* Un fil de platine ;
2* Une lampe à alcool ;
3** De« lames dégraissées {voir p. 28) ;
6r De l'alcool ;
5° De la thionine phéniquée.
Ce qu'il faut faire :
I® Faire le prélèvement : Tirrigalion est suspendue deux heures au moins avant le prélèvement ;
Flamber au rouge le fil de platine pendant qu'on défait le pansement ;
Rechercher sur la plaie le point qui paraît le plus infecté (sphacèle, point grisâtre, etc.) ;
Frotter le fil de platine sur ce point de façon à recueillir quelques sécrétions ;
Faire de préférence plusieurs prélèvements dont un en point déclive.
2** Faire l'étalement : tenir la lame, étiquette en haut, de la main gauche, étaler la sécrétion avec le fil de platine tenu de la main droite par une série de mouvements circulaires. Faire l'étalement aussi mince que possible ;
Flamber le fil de platine avant de le reposer ;
Marquer sur Téfiquelte le nom du blessé.
3® Fixer à la flamme, en passant la lame trois fois dans une flamme bleue.
4** Colorer : Verser sur la préparation de la thionine phéniquée ;
Laisser agir le colorant une demi-minute à une minute ;
Laver à l'eau rapidement ;
Sécher en épongeant au papier-filtre.
5® Examiner à l'immersion i/ia.
m DIAGNOSTICS BIOLOGIQUES EN CLIENTÈLE
Ce qu'il faut voir :
I** Des cellules avec noyaux colorés en violet, ce sont des leucocytes :
Mononucléaires, s'ils n'ont qu'un noyau ;
Polynucléaires, si leur noyau est multilobé ;
2** De& débris cellulaires colorés en violet ; .
3" De grandes cellules plates avec un petit noyau violet : cellules de la peau ;
4* Des corps arrondis colorés en vert : hémaiies ;
5^ Des microbes colorés en violci foncée Ils m inrésenteBi asH» deux aspects :
A, Petits points plus ou moins arrondis : cocci ; Par deux : dîplocoques ;
Par quatre : tétrades ;
En chaînettes : chaînes de cocci (se rapportant te plus souvent au streptocoque) ;
En amas : amas de cocci (le plus souvent staphylocoques).
B. Petits bâtonnets plus ou moins gros et longs ;
Bacilles isolés ou réunis par deux : diplobacilles, ou en chaînes, streptobacilles.
Le nombre importe plus que la qualité (Garrel).
En effet la morphologie est insuffisante pour faire des identifications certaines. C'est ain^i que nous avons insisté sur deux éléments sporules aérobies non pathogènes pour lanimal et que Ton rencontre sur les plaies par suite des souillures terrestres, ce sont le 5. mycoïdes qui rappelle l'aspect des anaérobies du type vibrion septique et le 6, pseudo-tetanicus qui rappelle l'aspect du bacille tétanique. Pour ne pas faire la confusion, il faudra recourir aux cultures et inoculations.
On fera une numération des microbes par champ de microscope (oc. 3, obj. immers. 1/12).
Cette numération est approximative lorsque le nombre est élevé :
I** innombrables ;
2® 5o à 100 par champ ;
3° 3o à 5o par champ ; 4® 2o à 3o par champ ; 5® i5 à 2o par champ ; 6^ lo à i5 par champ ;
Au-dessous, on voit peu de microbes, et il est possible de faire une numération. On compte les microbes dans dix champs,
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Fig. 16. — Frottis de plaie de guerre à la douzième heure.
On y volt en gris quelques globules rouges et, faciles à reconnaître avec leurs noyaux contournés, des polynucléaires neutrophiles, un d'entre eux a phagocyté un bâtonnet (centre de la figure). En haut et à gauche, un amas de cocci en grappe, en haut et à droite, une chatnette de cocci. Au milieu iin bâtonnet sporulé, de chaque côté des bâtonnets non sporulés dont deux entrecroisés, un diplocoque un peu au-dessous de ces bacilles.
puis en un autre point de la préparation on recommence. Faire la moyenne. Les résultats sont relatifs.
Ce qu'il faut dire :
(( i4. La désinfection doit faire baisser le nombre des microbes. S'il reste stationnaire plusieurs jours, ou s'il augmente, le chi-^ rurgien doit examiner la plaie et rechercher les causes de l'arrêt de la désinfection : insuffisance de l'irrigation, nécessité d'augmenter le nombre des tubes, de les changer de place ou de les remplacer, présence de supports microbiens, tels que sphacèle, corps étrangers, etc., régions de la plaie non irriguées, pansements mal faits, fautes de technique, etc.
B. Lorsque le nombre des microbes est voisin de un par champ, faire les examens avec beaucoup de soins sur plusieurs prélèvements faits en différents points de la plaie.
Sî l'on observe seulement des coccî ou des dîplocoques isolés, si l'on q.'en trouve qu'un pour quatre ou cinq champs et si ce résultat est vérifié par deux ou trois examens successifs à un ou deux jours d'intervalle, la désinfection est pratiquement atteinte, le chirurgien peut fermer la plaie avec la quasi-certitude de succès opératoire, qu'il s'agisse d'une plaie des parties molles ou d'une fracture ouverte. » (Vincent.)
Ensemencement des milieux de oulturesf
Ce qu'il faut : .
I® Le pus à ensemencer en tube ;
2** Des milieux de cultures. En pratique usuelle, deux milieux suffisent : le bouillon ordinaire et de la gélose ordinaire. Pour le praticien de campagne, la gélose peut suffire ; •
3® Un fil de platine monté ;
4*» Une étuve à 3f ;
5® Une lampe à alcool.
Pour l'ensemencement des pus où l'on soupçonne une mycose, il faut employer les tubes de gélose de Sabouraud.
BACTERIOLOGIE
Ce qu'il faut faire :
I® Flamber le fil de platine ;
2° Déboucher le tube de pus en flambant rorîfîce, recueillir dans l'anse du fil une trace de pus à ensemencer. Refermer le tube ;
3® Ouvrir le tube de bouillon, et en le louant incliné porter Tanse de platine chargée jusqu'au niveau du bouillon dans lequel on dilue le pus recueilli. Fermer en flambant Torifice du tube et agiter pour mêler ;
4** Avec le même fil de platine, que l'on conserve toujours en main, on ensemence, par des traînées longitudinales, un ou deux tubes de gélose inclinés sans recharger. Après l'ouverture et avant la fermeture du tube, il convient d'en flamber soigneusement Tarifice ;
5® Porter les tubes ensemencés dans Tétuve à 37® pendant 24 heures.
Si on soupçonne un pus mycosique (sporotrichose) , on ensemence ce pus avec la pipette ou le fil de platine sur un tube de gélose de Sabouraud, que l'on bouche au coton et qu'on laisse huit jours à la température de la chambre.
Les pus fétides seront ensemencés dans des tubes à moitié pleins de gélose glucosée droite. Dans un bainmarie, cette gélose est liquéfiée, puis ramenée à 4o** ou 45° ; c'est dans cette gélose liquide que l'on porte le pus à ensemencer. Agiter le tube de façon à ensemencer les parties profondes.
Refroidir ensuite le tube, les anaérobies se développeront dans les couches inférieures.
Fig. 17.
Tubes de milieux.
Bouillon. Gélose inclinée.
Les pus à gonocoques et à méningocoques ne poussent bien que sur des géloses spéciales (gélose au sang, gélose ascite) qu'il faut demander aux laboratoires centraux.
Fig. 18. — Gomment il faut flamber un tube en tournant dans la flamme.
Quant à la culture du bacille de Koch, il n'est pas nécessaire d'y recourir, les inoculations seules fournissent des résultats satisfaisants.
Fig. 19. — Comment il faut tenir un tube pour un ensemencement bactérien au fil de platine.
Résultats fournis par la ouKure de 24 heures d'un pus
Ce qu'il faut voir :
Quand la culture a poussé sur bouillon, le bouillon se trouble durant l'agitation ; quand elle a poussé sur gélose inclinée, la surface de la gélose a perdu son luisant et son unité, des points blanchâtres s'y sont déposés donnant un aspect maculeux ou papuleux ou formant des traînées épaisses à bords festonnés.
Sur gélose, il est facile de se rendre compte de la pureté de la culture par l'aspect des colonies développées. La culture est-elle formée d'une seule espèce de colonies ? 11 est probable qu'elle est pure. Si plusieurs espèces de colonies se sont développées, il s'agit probablement d'associations microbiennes. Le diagnostic isolé de chaque élément en cause se fait à l'aide de nouvelles cultures faites en ensemençant une seule de. ces colonies.
Nous savons le plus souvent, grâce à l'examen morphologique, que l'élément à étudier est un coccus ou un bacille. Si ce renseignement fait défaut, il suffît de recueillir sur le tube de gélose, à l'aide du fil de platine, une trace d'une des colonies microbiennes ; on dilue l'élément recueilli dans une goutte d'eau distillée sur lame ; on sèche ensuite, on fixe et on colore.
Le diagnostic, nous le verrons, s'aide de ces deux notions fournies par la culture %i la morphologie.
Ce qu'ii faut dire :
I** D'après la culture sur bouillon.
a) Coccî.
— Léger trouble, dépôt de grumeaux en mie de pain qui se dissolvent par agitation = streptocoque.
— Trouble marqué, dépôt jaune, collerette sur le verre à la surface du liquide = staphylocoque.
— Léger dépôt purulent et visqueux, liquide clair = tétragène.
b) Diplocoques.
— Ne pousse pas ou mal = gonocoque, ménihgocoque ; les cultures, si nécessaire, seront faites sur bouillon mêlé à du liquide d'ascile.
— Trouble léger, dépôt purulent = pneumocoque.
c) Baxiilles,
— Bouillon verdâtre, odeur spéciale = 5. pyocyanique.
— Trouble, 'aspect moiré par agitation = h, Eberth,
— Trouble, pellicule, dépôt floconneux, odeur fécaloïde = coli-hacille.
— Trouble uniforme = b. dysentérique (se distingue des précédents par son immobilité durant iexamen entre lame et lamelle).
— Trouble uniforme, bacille extrêmement mobile = 5. proteus,
— Trouble uniforme, précipité adhérent au tube = pneumobacille.
— Ne pousse pas = cocco-bacille de Pfeiffer,
— Ne pousse pas, qu'en milieu anaérobie .= b. de Nicolaïer.
— Ne trouble pas, précipité blanc = b. charbonneux,
2® D'apbès la culture sur gélose inclinée.
a) Cocci.
— Colonies petites, 2 millimètres de diamètre, grains de semoule, centre opaque, bords transparents = streptocoque.
— Colonies petites, transparentes et confluentes = entérocoque.
— Colonies arrondies, saillantes, épaisses, jaune pâle, d'or ou blanches = staphylocoque (citreus, aureus, albus).
— Colonies arrondies, saillantes, concentriques = m. caudidus.
— Colonies blanches, épaisses, gluantes = tétragène.
b) Diplocoques.
— Culture ne pousse pas ou très mal à moins que l'ensemencement soit copieux (recourir à des milieux spéciaux) = gonocoque.
— Cultures larges, aplaties, à bords irréguliers, translucides
et visqueux = méningocoque (ensemencement copieux de pus méningé) .
— Colonies de la grosseur d'une tête d'épingle, plates, transparentes, gouttelettes de rosée = pneumocoque,
c) Bacilles.
— Colonies brunâtres, milieu fluorescent = b. pyocyanique.
— Colonies en taches de bougie rapidement extensive d'un gros bâtonnet sporulé = 5. mycoïdes, anthracoïdes ou mésentericus.
— Colonies peu épaisses, bords translucides, reflets bleutés = 5. d'Eberth.
— Bandes opaques ou irisées, à bords frangés = colibacille,
— Comme bacille d'Eberth = b, dysentérique (mais immobile).
— Culture grise envahissant en quelques heures toute la gélose = b. proteus.
— Colonies grisâtres, confluentes, visqueuses = pneumobacille.
— Ne pousse que sur gélose ensanglantée = cocco-bacille de Pfeîffer.
— Colonies blanchâtres, gaufrées = b. charbonneux.
' — Colonies sèches et finement plissées donnant un voile sur Teau de dépôt = 6. subtilis.
— Colonies grisâtres, transparentes = 5. diphtérique^. Malgré les distinctions schématiques de ce tableau, on voit que
souvent les caractères des cultures sont les mêmes pour des microbes différents. Il ne faut pas s'en laisser imposer par l'aspect des cultures ; on s'aidera de laspecl morphologique et de la recherche des affinités tinctoriales ; au besoin, des inoculations seront .pratiquées pour résoudre le problème.
Les traités de bactériologie apporteront de précieux renseignements.
1. En cas d'angine, il est nécessaire d'ensemencer non de la gélose, mais du sérum coagulé de J)çeuf, où le bacille diphtérique pousse avec plus de facilité.
En cas d'hésitation, le tube de gélose sera envoyé dans un laboratoire central.
Pour l'expédition, voici comment on procédera : on débouche le tube en flambant Torifice et, à laide d'une pipette stérile et préalablement flambée, on aspire le liquide de dépôt qui séjourne au bas de la gélose. Ceci fait, nouveau flambage d'orifice ; on bouche, le coton du tube est flambé légèrement, puis enfoncé un peu, à l'aide d'une pince flambée, de façon à permettre de boucher le tube avec un bouchon de\ caoutchouc préalablement bouilli. Ainsi le tube, fermé par un coton stérile, surmonté d'un bouchon hermétique, peut affronter le voyage : on le dépose dans une boîte en bois, garnie de coton. Envoyez par la poste avec l'indication « pressé w.
Diagnostic du streptocoque dans une suppuration
Pour affirmer la présence du streptocoque dans une suppuration, il ne suffit pas de le voir sur les frottis sous la forme de chaînettes de cocci, il faut le cultiver et étudier les caractères de ses cultures.
I** Du bouillon ordinaire ou du milieu T additionné de 1/2 à 1/5 d'albumine d'œuf alcaline ;
2** Des tubes de gélose au sang : fondre la gélose, la maintenir à 45**, additionner i centimètre cube de sang humain citrate recueilli stérilement par ponction veineuse par 10 centimètres cubes de gélose ;
3** Du lait stérilise ;
4** De l'eau peptonée glucosée à la bile : ajouter au milieu T un dixième de son volume de bile de bœuf stérile.
Ce qu'il faut faire :
I** Ensemencer largement dans l'eau peptoiïéc glucosée à l'albumine d'œuf ; rechercher à la huitième heure de culture le^
chaînettes de cocci entre lame et lamelle. Pour cette recherche, on prélève à la pipette capillaire, sans agiter le tube, le fond de la culture.
Après 24 heures, si la culture est pure, le bouillon est clair et présente seulement un dépôt granuleux en mie de pain ;
2*^ On dilue une goutte de cette culture de 8 heures dans un tube de gélose au sang maintenu à 45® et* on coule ensuite dans une boîte de Pétri. ïl est plus simple d'ensemencer un tube de bouillon auquel on a ajouté i centimètre cube de sang stérile. L'hémolyse se voit alors par l'aspect laqué rouge rubis que prennent les couches qui surnagent lé culot de globules rouges.
3® Une autre pipette de culture est projetée dans le lait. • 4** Ensemencer le milieu peptoné glucose à la bile (Weissenbach).
Ce qu'il faut voir :
I** Après 24 heures, le streptocoque donne sur bouillon des cultures en mie de pain, grumeleuses très spéciales. Le plus souvent, le bouillon ne se trouble pas. Mais on peut voir des streptocoques troublant le bouillon. Ceux-ci le plus souvent peu pathogènes ;
2® Les plaques de gélose au sang présentent après la 12* heure de très petites colonies entourées d'un halo blanc jaunâtre d'hémolyse de 1/2, I et 2 millimètres de diamètres = streptocoque hémoly tique. Le streptocoque de la bouche, ceux du tube digestif, de l'endocardite chronique ne sont pas hémoly tiques et ne donnent pas de halo.
3** Le streptocoque type coagule le lait en masse. Les streptocoques peu pathogènes ne coagulent pas le lait. '
4** Les streptocoques hémoly tiques et non hémolytiques ne poussent pas sur l'eau peptonée glucosée à la bile, contrairement à l'entérocoque qui donne une abondante culture trouble en 18 à 24 heures (épreuve de Weissenbach).
Donc, en règle générale, le streptocoque très pathogène des plaies : ne trouble pas le bouillon, coagule le lait et hémolyse.
Ces streptocoques foiTt aussi moins fermenter les sucres que les streptocoques peu pathogènes.
Inoculations à ranimai
Les inoculations pratiquement sont utilisées pour deux recherches : celle du pneumocoque virulent et celle du bacille de Koch. Les autres inoculations, sauf celle du singe pour la syphilis et la poliomyélite aiguë qui doivent être réservées aux, laboratoires spéciaux, sont sinon inutiles du moins superflues. Le praticien peut facilement s'en passer.
Ce qu'il faut :
I** Le pus à étudier pour là recherche soit du pneumocoque, soit du bacille de Koch, ou une culture sur gélose de 48 heures dans le cas pii Ton soupçonne la présence du pneumocoque ;
2® Une seringue en verre et une aiguille soigneusement bouillie ;
3** Pipette. Verre de montre. Un lube de bouillon. Bec Bunsen.
4* Un animal, dans l'espèce, un cobaye ou deux pour l'inoculation tuberculeuse, ou une souris blanche pour Tinoculation pneumococcîquc.
Ce qu'il faut faire :
1° Puiser à Taide de la pipette flambée quelques gouttes de pus, les verser dans le* verre de montre et les diluer avec une égale partie de bouillon ; 1
2® Remplir la seringue montée ; ^
3® Pratiquer l'injection :
A la souriSy injecter quelques gouttes sous la peau de la région dorsale. La souris sera maintenue dans une épaisse compresse de toile. Attention aux morsures.
Au cobaye, quand il s'agit de pus dont on ne doit injecter que quelques centimètres cubes, on fera l'injection sous-cutanée (l'injection intra-péritonéale étant réservée aux sérosités pleurale et ascitique contenant peu d'éléments pathogènes). L'animal
sera maintenu à deux mains par un aide qui tire sur les membres inférieurs et sur la tête. La piqûre est faite dans un pli de la région inguinale. Il n'est pas nécessaire de faire une asepsie Icxîale. On injecte 4 à 5 centimètres cubes dans la région sous-cutanée ;
4° Mettre Tanimai en cage isolée :
La souris, 48 heures. Après ce temps, si le pneumocoque est vii^ulent,- là souris est morte ou agonisante. Un frottis de sang recueilli dans le cœur avec une pipette, coloré au Gram, y. fait voir le diplocoque lancéolé et encapsulé prenant le Gram. L'inoculation est alors positive.
Si la souris ne se ressent pas de l'inoculation, l'inoculation est . négative, le pneumocoque est absent ou non virulent.
Le ou les cobayes, 4 à 5 semaines. Après ce temps, si le pus inoculé est tuberculeux, il s'est développé un chancre tuberculeux d'inoculation. Ou bien les ganglions inguinaux sont très augmentés de volume. L'animal est tué (par un coup de revers de main sur la nuque) et autopsié : l'infiltration caséeuse des g-anglions inguinaux, la tuméfaction de la rate qui est bourrée de granulations miliaires, quelquefois caséeuses, la présence de quelques granulations dans le foie et le poumon permettent d'affirmer la nature tuberculeuse du pus inoculé.
Si, au bout d'un mois, l'animal ne maigrit pas, ne présente pas de ganglions inguinaux, attendre deux mois pour faire son autopsie. Dans le cas où toute lésion tuberculeuse inanque à l'autopsie, le diagnostic de tuberculose en évolution doit être éliminé.
Les inoculations dans l'oreille du. lapin pour le diagnostic de l'infection streptococcique sont inutiles et souvent illusoires.
Ce qu'il faut voir et ce qu'il faut dire :
Recherche de la nature tuberculeuse d'une suppuration ou d'un exsudât.
I** Suppuration, crachats, urines. Le liquide a été dilué dans
du bouillon, et injecté sous la peau du cobaye dans la région inguinale.
2** Exsudât séreux. Injection dans le péritoine de 5 à lo centimètres cubes.
Résultat négatif ; nature non tuberculeuse presque certaine, réserve faite pour les anciens liquides dont les bacilles ont disparu (par suite d'infections secondaires ou d'injections modificatrices).
L'animal au bout de 6 à 8 semaines n'a pas maigri, ne présente ni ulcération dans la région inoculée, ni ganglion caséeux dans son voisinage, ni tubercule dans la rate, le foie et les poumons.
Résultat positif : tuberculose certaine, si deux ou plusieurs cobayes inoculés en même temps présentent des lésions analogues. Se méfier des résultats positifs isolés, car le cobaye peut être contaminé dans sa cage par un voisinage infectieux. En règle générale, les cages seront en fer, flambées après chaque évacuation, et maintenues très proprement de façon à éviter les contagions intérieures. Quinze jours après l'inoculation apparaît une ulcération au point inoculé. Puis la région inguinale correspondante présente des adénopathies volumineuses, l'animal maigrit ; si on le tue vers la sixième semaine, les ganglions inguinaux sont caséeux, la rate est volumineuse, farcie de nombreux tubercules, le foîe en contient quelques-uns, on peut observer aussi des localisations pulmonaires. Pour plus de certitude, faire un frottis et rechercher les bacilles après coloration au Ziehl.
Si l'inoculation est intrapéritonéale, les ulcérations et bubons font défaut ; les lésions de la rate et du foie persistent, par contre, et même paraissent plus accentuées.
Dans les cas oiîi Ton désire, après inoculations sous-cutanées, des résultats rapides, on recueillera un ganglion inguinal volumineux au quinzième jour, on en fera des frottis pour y rechercher le bacille de Koch.
Recherche du pneumocoque virulent.
Inoculation sous-cutanée à la souris.
Après 24 à 48 heures au plus tard, elle meurt si le pneumo-
coque est virulent ; on en fait l'autopsie. Avec des pinces flambées, on saisit la pointe du cœur, uû simple attouchement avec une tige de verre chauffée à blanc suffit pour stériliser l'endroit où ont enfoncera la pointe cassée et flambée d'une pipette stérile. Aspirer une goutte de sang. Etaler ce sang sur une lame pour la recherche du pneumocoque, l'ensemencer sur gélose pour les cultures. '
Nous avons déjà dit que les autres inoculations n'ont aucun ou presque aucun intérêt pratique. L'inoculation sous la peau de l'oreille du lapin d'un produit streptococcique dont on veut apprécier la virulence (après 48 heures, oreille tombante, rouge, tuméfiée, chaude, érysipélateuse), Tinoculation sous-cutanée au cobaye d'un exsudât pseudo-membraneux pour affirmer la virulence du bacille diphtérique, l'inoculation de la peste sur les narines du rat, de la . dysenterie dans le rectum du jeune chat, du liquide méningococcique dans la plèvre du cobaye, sont autant d'expériences qui, bien entendu, sont utiles, mais dont les renseignements sont ou exceptionnellement recherchés, ou insuffisamment spécifiques. Le praticien peut s'en passer et les abandonner aux laboratoires de bactériologie.
Comment oolorer les oils microbiens ?
La présence de cils, leur nombre, leur répartition, sont autant de caractères morphologiques utilisables pour l'identification rapide des germes pathogènes tels que : le vibrion cholérique, le bacille pyocyanique, les bacilles typhiques et paratyphiques, le proteus, etc. Si la recherche des cils n'est pas entrée dans la pratique bactériologique courante, c'est que les procédés de coloration en usage jusqu'ici étaient délicats et infidèles. La méthode de coloration décrite par ïribondeau en collaboration avec Fichet et Dubreuil ( C. R. de la Société de Biologie^ I*' avril 191 6) est au contraire d'une exécution facile et d'une grande efficacité. Aussi croyons-nous utile d'en donner ici la technique avec les améliorations iucdiles que nous a signalées l'auteur.
Ce qu'il faut avoir :
I® Les microbes à examiner étalés convenablement sur lames de verre.
Les colonies sur milieux géloses (gélose au bouillon ordinaire, gélose lactosée tournesolée, gélose de Dieudonné, etc.) sont utilisables ; mais le milieu de choix pour la culture des microbes en vue de la coloration des cils est la solution' de panse Martin (sans viande), gélosée à 2 p. 100 et très légèrement alcalinisée. Prélever, de préférence, vers la quinzième heure d'incubation à 37**, une parcelle de colonie avec une pipette Pasteur à effîlure boutonnée, et en faire une émulsîon peu épaisse dans l'eau distillée.
Choisir des lames porte-objets neuves (à défaut faire bouillir les lames usagées dans une solution aqueuse de bichromate de potasse à 5o p. 1000, additionnée de 100 centimètres cubes d'acide sulfurique, rincer abondamment). Les nettoyer à l'alcool ; sécher avec un linge fin très propre.
Reposer sur la lame près d'une extrémité, une grosse goutte d'émulsîon microbienne. Incliner la lame jusqu'à la verticale de façon que la goutte atteigne l'extrémité opposée, en laissant derrière elle une large traînée humide. Réaspirer immédiatement tout l'excès d'émulsîon ; laisser sécher la traînée, là lame étant posée verticalement ; fixer en arrosant d'alcool absolu dont on enflamme les dernières gouttes restant sur la lame ; laisser refroidir. La préparation peut être colorée.
2** Une solution mordançante à Valun et au tanin.
Faire une solution saturée d'alun. Pour cela : dissoudre 12 parties d'alun de potasse pulvérisé au mortier dans 100 parties d'eau distillée chaude ; laisser reposer, k froid, pendant une journée, pour que l'excès d'alun cristallise : décanter et filtrer.
Préparer, d'autre part, une solution à 10 p. 100 de tanin à l'éther (ou à défaut, de tanin à l'alcool) dans l'eau distillée chaude.
Mélanger les deux solutions précédentes, à raison de 2 volumes de solution d'alun pour i volume de solution tannîque. Chauffer
le mélange à raufoclave à 120® pendant une demi-heure (important, car sans cette précaution certains tanins sont inutilisables) ; fdtrer chaud, sur papier, au sortir de Tautoclave ; filtrer de nouveau après refroidissement s'il existe un trouble. Le liquide brun constitue le mordant,
3** Une solution colorante^ à base de cristal violet, soigneusement titrée.
Broyer du cristal violet dans un mortier ; verser dans un flacon ; ajouter, par gramme de poudre colorante, 20 centimètres cubes d'alcool éthylique absolu ; agiter (solution mère).
Faire en petite quantité (2 centimètres cubes par exemple), les dilutions ci-après :
Solution mère i volume -f alcool éthvlique absolu 9 volumes .= colorant à i/aoo.
Solution mère 2 volumes -f alcool éthyîique absolu 9 volumes r= colorant à i/ioo.
Solution mère 4 volumes + alcool éthylique absolu 9 volumes = colorant à i/5o.
Rechercher, par tâtonnement, quel est le meilleur de ces 3 colorants.
Pour ce faire, verser dans une casserole métallique de ménage d'enfant, ou dans une petite capsule de porcelaine, 5 centimètres cubes de mordant, puis o ce. 5 de lune des dilutions colorantes précédentes (qu'on mesure avec deux pipettes graduées appropriées). Un tour pour mélanger ; chauffer sur une grosse flamme. Aussitôt l'ébullition obtenue, verser le mélange sur une préparation de microbes de façon à recouvrir d'un coup toute la surface à colorer. Laisser agir une vingtaine de secondes, 3o au plus. • âans vider au préalable le mélange colorant, laver brusquement sous gros jet du robinet (pour éviter que la pellicule de surface se dépose sur la préparation) ; égoutter en secouant ; sécher en s'aîdant de la flamme.
Procéder de même pour chacune des 3 dilutions colorantes.
Comparer entre eux les résultats obtenus. Microscopiquement, le meilleur mélange est celui qui commence à précipiter aussitôt
qu'il a été versé sur la lame, ou dans les 5 secondes qui suivent ; un mélange qui contient déjà un précipité très apparent au moment où on le verse ou qui, au contraire, tarde à précipiter une fois versé sur lame, n'est pas bon. Microscopiquement, la dilution préférable est celle qui colore les cils le plus nettement, tout en ne laissant que peu de précipités sur le fond.
Cette épreuve terminée, on sait quelle quantité exacte d*alcool doit être ajoutée à la solution-mère pour la transformer en dilution colorante optima, résultat valable ultérieurement, tant qu'on continue à se servir du même lot de produits (alun, violet et surtout tanin) pour en faire des solutions nouvelles.
D'ordinaire, c'est la solution alcoolique de cristaleviolet à I p. loo qui remplit les conditions stipulées. 11 est exceptionnel d'avoir à essayer des dilutions colorantes plus étendues que le 1/200 ou plus concentrées que le i/5o pour trouver le litre de la dilution optima.
Ce qu'il faut faire :
Colorer les préparations en exécutant la même technique qui a servi pour les essais comparatifs des dilutions colorantes, c'cst-
Fig. 20. — Coloration des cils du Proteus à la méthode
de Tribondeau-Dubreuil.
Une certaine partie des cils est tombée sur la lame.
à-dire : porter à rébullition 5 centimètres cubes de mordant additionnés de o ce. 5 de solution optima de cristal -violet ; verser bouillant sur les microbes ; laisser agir environ ao secondes ; laver r sécher.
Fig. 21. — Cils des bacilles typhiques (méthode de Tribondeau). Quelques cils se sont détachés au cours de la préparation.
Fig. 22. — Vibrion cholérique et ses cils tels qu'on les obtient par la méthode de Tribondeau-Dubreuil.
' Les germes sont colorés en violet foncé, les cils en violet un peu plus pâle ; il y a toujours un certain précipité de fond, mais qui n'est pas d'habitude gênant.
N,-B. — On peut obtenir des cils aussi intensément colorés que les microbes en utilisant un mordant oîi solution tannique et solution d'alun entrent à parties égales, ce qui entraîne Temploi d'une dilution colorante plus riche en cristal- violet (à i/5o généralement) ; mais le fond e^t souvent surchargé.
Une préparation où les cils sont trop pâles, le fond étant resté propre, peut être renforcée par virage au brun-noir dans la solution de Fontana très étendue d'eau distillée ; laver à l'eau distillée ; sécher.
Inversement, une préparation à fond encombré de précipités granuleux ou réticulés, mais oij les cils sont fortement colorés, peut être corrigée par affaiblissement : verser sur la lame de la solution tannique dédoublée (donc à 5 p. loo; et sans alun) ; chauffer doucement en promenant pendant quelques secondes au-dessus d'une petite flamme ; laver rapidement 'dès que la teinte violette a un peu pâli ; sécher.
En cas d'insuccès, ne pas incriminer le procédé de coloration s'il a été rigoureusement exécuté, mais des particularités de cultures défectueuses. Réensémencer le microbe dans de bonnes conditions ; on fera des préparations avec des colonies à différents âges entre 6 et 24 heures, et on obtiendra des colorations satisfaisantes^.
