CHAPITRE V

Extraction de la sucrase des levures. — Sécrétion par l'asper^illus ■•niger. — Préparation de la sucraso à l'état sec. — Influence de la quantité et du temps. — Influence de la température. ■ — DilTércncc entre 'les propriétés des sucrascs d'origines différentes. — Rôle de l'acidité et de l'alcalinité du milieu. — Action de l'oxygène et de la lumière. • Action des substances chimiques. — Mode de sécrétion de la sucrase dans lies cellules. — Dosage de la sucrase. — • Méthode de Fernbach. — Méthode d'Effront.

La sucrase est une diastase capable de transformer le sucre de canne en sucre interverti. Le saccharose, sous l'action de la sucrase, se dédouble en fixant une molécule «d'eau et en donnant deux monosaccharides : le glucose et le lévulose

CI2H220I I + H^O = C'H'^o'i + C'IIi^O". sucre de canne glucose lévulose

La sucrase est très répandue dans la nature. On constate, ]ràv exemple, sa présence dans la salive, dans le suc gastrique •et dans l'intestin grêle.

Le sucre de canne, conservé pendant quelque temps dans la bouche, est transformé, sous l'action de la salive, en sucre interverti. Cependant, cette transformation n'est pas duc à l'action d'vme sécrétion des gdandes salivaires, mais bien à la sucrase élaborée par les nomlireuses bactéries qui se trouvent dans la salive. Au surplus, la substance active dont on constate l'apparition dans la bouche, ne transforme que des <]uantités fort limitées de sucre de canne.

Effront. Les Enzvmes. 5

GC ■ LES ENZYMES

Les diaslases du suc gaslrique sont douées d'un pouvoir interYcrlisseur l^eaucoup plus énergique. Cependant, malgré cette énergie, l'inversion du saccharose ne s'achève pas encore dans l'estomac. Lue partie nolahle du sucre de canne ahsorbé pénètre dans la circulation sans avoir préalablement subi l'action des diastases et c'est seulement dans l'intestin grêle que la transformation devient complète.

On ne constate pas la présence dans le sang de substances actives capables de transformer le saccharose.

Le suc injecté dans les veines ou dans le tissu cellulaire d'un animal, se retrouve éliminé dans l'urine ; mais cette élimination ne se produit pas lorsque le sucre est injecté dans la veine-porte. Il traverse alors le foie et subit, en passant par cet organe, une action diastasique énergique qui l'intervertit complètement.

La sucrase est aussi très répandue dans le règne végétal : on la trouve dans les bourgeons, dans les fleurs ainsi que dans les feuilles d'un très grand nombre de plantes. En outre, de nombreuses moisissures, telles que Ynspei-gilhis niger, le iinicor raceniosus, le penicillum glaucuin, le peniciUum DiicJaiixi, Xaspergillus orizae, les levures et tout une série d'autres ferments, produisent aussi l'inversion du saccharose.

En règle générale, une cellule se nourrissant de sucre doit nécessairement contenir une sucrase.

Cette règle a été cependant combattue par Hansen qui a fait remarquer que la moisissure appelée monilia candida, tout en se nourrissant de saccharose, ne sécr.ète pas de sucrase. Cette assertion a été victorieusement réfutée par E. Fischer, qui, dans une étude plus aj)profondie de cette moisissure, a constaté qu'elle contenait en réalité une sucrase, mais que l'enzyme était retenu dans les cellules et n'apparaissait que difficilement au dehors.

Dans la littérature, la sucrase est désignée sous différents noms : on l'appelle ferment giucosique, cytozymase, zymase et invertine..

suc HASE O7

La découvcrlc de cet enzyme est duc à Dobereiner et à Mitsclierlicli. Ces savants ont constaté les premiers que la levure de bière intervertissait le saccharose. Ils ont encore remarqué que cette substance active peut être extraite des levures par un lavage à l'eau. Berthelot parvint le premier à isoler la diastase à l'état solide en la précipitant de l'eau des levures par l'alcool.

Mode de préparation. — Il existe différents modes de préparation de la sucrase.

On peut facilement obtenir la substance active en mettant de la levure de bière en contact avec de l'eau additionnée de quelques gouttes de chloroforme ; au bout d'vm certain temps, la substance acliA^e se dissout dans l'eau. On fdtrc ensuite le liquide pour le séparer des cellules de levure qui y sont en suspension.

Il va de soi c{ue la solution qu'on obtient ainsi est loin d'être composée miiquement de sucrase, la levure contenant, outre la sucrase, d'autres matières extractives qui entrent en solution en même temps que celle-ci. Malgré cela, l'infusion est très active et peut très bien servir à l'étude de la sucrase.

Un mode de préparation plus rationnel de cet enzyme consiste à l'extraire d'une culture d'aspergillus niger sur hquide Raulin. Toutefois l'extraction de la diastase de l'aspergillus niger exige, pour donner des quantités suffisantes d'enzyme, l'observation de certaines conditions sans lesquelles les résultats ne seraient y>sls satisfaisants.

La meilleure façon de procéder a été indiquée par Duclaux. Il conseille de laisser une culture d'aspergillus niger se dével(^pper sur une grande surface de liquide Raulin, pendant environ quatre jours, et, au moment où les moisissures formées ont pris une couleur verte ou brun clair, de soutirer le liquide el de le remplacer par de l'eau pure ou de l'eau sucrée. Sur ce nouveau liquide on laisse croître de nouveau l'aspergillus pendant 2 ou 3 jours jusqu'à épuisement

complet du milieu nutritif. A ce moment, les enzymes sécrétés par les plantes entrent en solution, et il ne reste plus qu'à filtrer le liquide pour le débarrasser des débris de moisissures qui peuvent s'y trouver en suspension. La solution de sucrase préparée de cette façon est très active et contient relativement peu d' impuretés .

Pour empêcher le liquide de s'altérer pendant la croissance ■de la plante, on peut l'additionner de quelques gouttes d'essence de moutarde qui, agissant comme antiseptique, préserve le milieu de l'invasion des ferments figurés sans nuire à la •tliastase. Cependant, il est préférable de cultiver la moisissure dans le liquide stérilisé, et d'ensemenser ce liquide avec une culture pure d'aspergillus niger. Lorsque la plante s'est suffisamment développée sur le liquide Raulin, on remplace cette solution par de l'eau distillée que l'on a eu soin de stériliser au préalable.

Pour obtenir la sucrase à l'état sec. Ed. Denathe indicjue le procédé suivant : on fait macérer pendant quelques temps ■de la levure de bière dans de l'alcool absolu ; on décante ensuite l'alcool, on filtre et on sèche en exposant à l'air. On obtient ainsi une masse cassante, que l'on pulvérise et que l'on fait de nouveau infuser dans de l'eau distillée. On fdtre ■cette infusion pour retenir les cellules de levure qui s'y trouvent. Cependant, comme les cellules passent facilement au travers du filtre, il faut encore s'assurer par un examen microscopique qu'elles ont toutes disparu du liquide. Dans le cas contraire, il faut filtrer à plusieurs reprises sur double fdtre. Lorsque le liquide est exempt de cellules, on l'additionne ■d'éther et on agite. On voit alors apparaître une substance visqueuse qui reste en suspension dans la partie supérieure ■du liquide et qu'on sépare du reste de l'infusion. Cette substance est ensuite traitée par de l'eau distillée et versée goutte à goutte dans de l'alcool absolu, où il se produit un précipité pulvérulent. Ce précipité, séparé du liquide, est lavé à l'alcool et séché dans le vide.

suc HA si; fny

Ce ])rorrdc'' |)(miii('I d^ihUMiir' une poudre ])lanclie, jionllanl dans l'eau et s'\ dissohaul 1res dillicilciiient. Elle se conserve pendant très lonylemps et possède un grand pouvoir diastasique. Ils scud^le liors de doute, cependant, qu'une notable partie de la substance active doit se coaguler par le fait des traitements à l'alcool et à l'ctlier et, par conséquent, devenir inactive.

La marcbe de l'inversion du saccbarosc par la sucrasc dépend de la quantité de substance active mise en œuvre, ainsi que des conditions pbysiques et chimiques du milieu dans lecpiel s'opère la translormation. L'étude des conditions spéciales qui favorisent ou retardent l'action diastasique est d'autant plus intéressante qu'elle fournit des données très précieuses, aussi bien au point de vue théorique qu'au point de vue pratique. Nous accorderons donc à cette question tout le développement qu'elle mérite.

Nous étudierons d'abord l'influence cju'exercent sur la vitesse de l'inversion la Cjuantité de sucrase et la température à laquelle on opère. Nous déterminerons ensuite le rôle du temps dans l'inversion, ainsi que l'influence de l'acidité et de l'alcalinité du milieu. iNous verrons enfui, comment la lumière, l'oxygène et un certain nombre d'autres substances chimiques, influent sur la vitesse de la transformation.

Influence de la quantité et du temps. — Lorsqu'on fait agir la sucrase sur une solution de saccharose, les résultats C[u'on obtient sont fort diilerents suivant la c]uantité de substance active employée,

Si l'on se place dans des conditions déterminées on peut constater un rapport presque constant entre la cjuanlité de sucrase employée et la quantité de sucre interverti. Cette proportion est, jusqu'à un certain point, indépendante de la richesse en sucre du liquide dans lequel travaille la cliastase.

Si, par exemple, on fait agir i et 2 centimètres cubes de

sucrase pendant le même temps et à la même tempéialurc, sur des quantités égales de saccharose, on constate qu'avec 2 centimètres cubes de sucrase on obtient deux fois plus de sucre interverti qu'avec i centimètre cube de substance active.

Toutefois, il faut remarquer que cette proportionnalité entre la quantité de substance agissante et la quantité du produit formé n'est pas toujours constante. M. Duclaux a observé que la loi de proj)ortionnalité ne se vérifie que si l'on emploie la sucrase à très faible dose, et que si l'on arrête l'inversion à son début. La proportionnalité subsiste jusqu'au moment où lo à 20 pour 100 du sucre est interverti, après quoi elle cesse.

Lorsqu'on étudie l'influence du tem^îs sur l'action de la sucrase, on constate des phénomènes absolument analogues.

L'invertine est un enzyme excessivement énergique. D'après M. Duclaux, i gramme de substance active transforme jusqu'à /iooo fois son poids de sucre. Cependant, tout en étant très énergique, l'action de cette diastase est relativement lente.

En abandonnant à la température de 5o° une solution de 10 pour 100 de saccharose avec i centimètre cube de sucrase nous avons obtenu les résultats suivants :

Après I heure. . . . 0,20 de sucre interverti.

— 2 lieures. ... o,4i —

Cette expérience permet de constater la grande lenteur avec laquelle se produit l'inversion. Remarquons, en outre, que la quantité de sucre interverti augmente proportionnellement à la durée de l'action.

Ainsi, après 2 heures, nous trouvons à peu près deux fois

suc RASE 71

[)Ius de sncre inlorvorli fju'api'cs une liciicccl, après 5 liourcs, presque cinq Ibis plus.

Mais à partir de ce rnomeiiL la proporlionnaliLé cesse d'exister. Si nous continuons, en ciVet, à suivre l'action de la sncrase tlans l'essai précédent, nous obtenons :

Après 10 lieures. . . i,'y2 de sucre interverti.

— ao — ... 3,12 —

Si la transformation s'était continuée avec la même vitesse qu'au commencement de l'action, on aurait obtenu :

Après 10 lieures. . . 3,00 de sucre interverti.

Le ralentissement que nous constatons commence au moment où environ 20 pour 100 du sucre a été transformé et, au fur et à mesure que l'inversion se poursuit, le ralentissement continue à s'accentuer.

La marche irrégulière que nous observons dans l'action de la sucrase a fait le sujet de différentes études et occupé beaucoup de savants. Elle a donné naissance à diverses hypothèses que nous examinerons dans la suite de cette étude. Contentons-nous maintenant d'enregistrer le fait et passons à l'action de la température.

Influence de la température. — • La température joue, dans l'inversion du saccharose, un rôle très important et exerce une influence considérable sur le degré d'activité de la sucrase.

A 0° l'invertine n'exerce qu'une action très faible, qui s'accroît considérablement avec la température. Cet accroissement se produit avec une certaine lenteur entre 5° et 3o°. Au contraire, au delà de cette température, de 3o° à 5o°, l'activité diastasique augmente d'une façon très rapide.

En laissant agir pendant imc heure l'inAcrline des levures

sur une solution de sucre à 20 pour 100, nous avons obtenu^

avec la même quantité de sucrase, à des températures diflerentes, les chiffres suivants :