CHAPITRE VIII

AMYLASE

Présence de Tamylase dans les cellules végétales et animales. — Préparation. — Méthode deCohnheim. — Méthode de Lintner. — Méthode tl'Effront. — Méthode de A^'rohlewsky. — Propriétés. — Influence des quanlitcs, du temps, de la température. — Influence des agents chimi- (jues : acides, alcalis, sels. — Suhstances activant l'action diastasique.

L'enzyme nommé amylase ou simplement diastase est un ferment soluble hydratant l'amidon et le transformant en maltose et dextrines.

L'existence de cet enzyme a été, pour la première fois, constatée dans le gluten, en i8ifi, par KircholT. Dubrunfaut, Payen et Persoz ont ensuite poursuivi l'élude approfondie de cette substance.

L' amylase est très répandue dans la nature. Elle se trouve dans l'orge, l'avoine, le riz, le maïs, et, d'une façon générale, dans toutes les céréales.

Les grains crus sont peu riches en diastase, l'amylasc se formant surtout au cours de la germination.

On a constaté la présence de l'amylase dans les tubercules de pommes de terre ainsi que dans les feuilles et les pousses de différentes plantes.

La transformation de l'amidon en hydrates de carbone assimilables par les cellules vivantes se faisant généralement sous l'action de l'amylase, on conçoit que cette substance joue un rôle très important dans la formation des tissus végétaux. Toutefois la transformation de l'amidon ne se produit pas toujours à l'aide de l'amylase et, par le fait qu'une cellule

opère la transformation des matières amylacées, il n'est nullement prouvé qu'elle secrète cette diastase.

Nous verrons plus loin, en effet, cju'il existe encore d'autres enzymes agissant sur l'amidon en le rendant assimilable et propre à la construction des tissus.

Wartmann a soutenu c[ue l'assimilation de l'amidon ne se fait pas toujours sous l'influence des enzymes et il a cru démontrer que le protoplasma seul peut, par lui-même, produire une action dissolvante et hydratante sur l'amidon.

Cette manière de voir peut cependant être sérieusement discutée. Il est vrai que dans les feuilles des plantes où il se produit une transformation très active de l'amidon, on trouve généralement des quantités de diastase peu en rapport avec le travail constaté. Il est également vrai que souvent les tiges et les pétioles ne sécrètent pas de substances actives, tandis qu'on constate dans ces organes une assimilation énergique de l'amidon. Mais ces faits ne sont pas suffisants pour prouver l'intervention directe du j)rotoplasma dans l'hydratation de l'amidon.

Le fait qu'on n'a pas réussi à trouver del'amylase clans des cellules peut simplemeut provenir de difficultés de l'ordre de celles qui se présentent dans l'étude de la sucrase ; en d'autres termes, l'amylase peut être plus ou moins retenue à l'intérieur des cellules ou entrer en combinaison avec d'autres substances et devenir ainsi plus ou moins soluble.

Ainsi que nous l'avons constaté pour le tannin, l'amylase se présente parfois sous une forme inactive, parce que les conditions dans lesquelles elle se trouve ont une influence défavorable sur son action. En ce cas, elle acquiert de nouveau ses propriétés, aussitôt cju'elle est placée dans des conditions favorables.

Nous savons, de plus, que l'effet produit par un enzyme dépend surtout des conditions du milieu et nous pouvons bien admettre c|ue, dans les cellules vivantes, l'action des diastases est plus énergique cpie dans nos expérimentations.

AMVLASE i-y.i

11 csL |)robal)lo, d'alUciirs, qu'a\cc une cpianlilé do subslancc acliA'c indosablo on jiciil oljlonu- dos cil'cls cncr^if[iios, si les cojidilioiis du inilicii se inonlicii! l'aNorables. Si ddiic, l'anivlase n'a pas clé Irouvéc dans les diU'éi'CJils organes végélau.v que l'on a examinés, on peut allribner ces résnllals négatils aux dillércnles circonslances f|vic nous venons d'énumérer. Il n'est tlonc nullement établi que le protoplasma soit capable, sans l'intervention d'enzymes, d'iiydratcr l'amidon, et toutes les données que nous possédons sur les enzymes tendent plutôt à prouver que l'on se trouve encore ici eji présence d'actions diastasiques.

L'aniylase se retrouve encore, d'après quelques auteurs, dans les moisissures. Ainsi, l'aspergillus niger, le penicillum glaucum, cultivés dans des conditions déterminées, sécréteraient une certaine quantité d'amylasc, mais la présence de cette diastase dans les moisissures est cependant très rare.

La diastase hydratant l'amidon se rencontre, non seulement dans le règne végétal, mais aussi dans les sécrétions animales. On constate sa présence dans la salive, dans le suc pancréatique et dans le foie.

La présence constante de la substance active dans la salive peut être attribuée à deux causes différentes :

On peut admettre que l'amylase est sécrétée par les glandes salivaires, mais on peut admettre aussi qu'elle est due aux ferments figurés qui se trouvent dans la bouche et qui se nourrissent de matières amylacées.

Claude Bernard, qui a étudié cette question, se montre partisan de la dernière hy])o[hèse. En chavdlant de la salive à loo", il a constaté la destruction complète de la substance active. Cette salive ayant perdu la propriété d'agir sur l'amidon redevient active lorsqu'on l'abandonne pendant quelque temps à la température ordinaire.

Il attribue ce phénomène au développement dans la salive de nouveaux ferments capables de fournir au liquide ambiant de nouvelles quantités de diastase.

L'apparition de la diaslasc pourrait cependant être expliquée par l'action de la tcm])éralure sur les fermenls de la salive. Certaines celhdes qui n'ont pas été détruites par la chaleur retiendraient encore de l'amylase, et celte diastase, lorsqu'on abaisse la tcmpéralnrc, se dilTuserait dans le liquide.

Quoi qu'il en soit, l'apparition de l'amylase dans la salive peut s'expliquer autrement c[ue par une sécrétion des glandes.

Pour résoudre définitivement cette question, il faudrait répéter l'expérience de Claude Bernard en se plaçant dans des conditions où l'intervention de tout ferment figuré pût être évitée.

Préparation de l'amylase. — L'amylase peut être précipitée de ses solutions, soit par entraînement, soit par l'action de l'alcooL

D'après Colmlieim, on peut extraire la diastase de la salive par la méthode suivante : on active la salivation en rinçant la bouche avec de l'éther. La sahve est alors recueillie et additionnée d'une faible dose d'acide phosphorique. Le liquide acide est ensvute neutralisé avec grande précaution à l'aide d'eau de chaux très diluée. Il se forme ainsi un phosphate de calcium qui se précipite en entraînant la diastase ainsi que d'autres matières azotées. Ce précipité est séparé par filtration, puis lavé sur le filtre avec un volume d'eau égal à celui de la salive employée. Par le lavage, la diastase entre en solution. On la précipite de cette solution par une addition convenable d'alcool.

La préparation de l'amylase se fait beaucoup plus facilement à l'aide d'une infusion de malt. Payen a constaté le premier que les substances actives d'une infusion peuvent être précipitées de la solution par une addition convenable d'alcool. Le produit qu'on obtient ainsi est malheureusement loin d'être pur; de plus, il est très altérable à l'air, s'oxyde et devient très facilement inactif en prenant une couleur très foncée.

L'altération de l'amylase est facihtée par les substances

AMYLASI': ,3-,

(Uranycros |)i('rl|)ilr('s cii mriii(> Icinps que la diaslasc par l'alcool. On a projxisr (IllVrionls iiionoiis poiii' (''NihM'ccs inconvcnlcnls. Paycn et Perso/, conscillenl. par cxeinplc. (l'ajonlor à rinliision de malt une c|vianlilé d'alcool insiillisante pomj)récipiter la diasiase, [)nis de porler la sohilion alcoolique à la tcnqx' rature de jo", lem])ératnre cpii, d'après eux, éliminerait de l'inl'nsion les matières élrangères, |)arliculièrement les matières albumiiioïdes. Cette opération terminée, on sé])are les substances coagulées du lic[uide qui les renl'erme et on ajoute un excès d'alcool pour provoquer une pi'écipiiation de l'amylase.

Par cette méthode, on obtient un produit blanc et peu allérable, mais ne possédant qu'une activité très faible.

On obtient des résultats beaucoup plus ap])réciables ])ar la méthode de Lintner :

Une partie de malt linement broyée est diluée dans li parties d'alcool à 20 pour 100; on laisse macérer pendant 'ili heures ; on sépare ensuite le liquide du malt, on le fdtre (ît on ajoute à chacjue volume de liquide filtré 2 volumes d'alcool absolu. Il se forme ainsi un précipité floconneux; on décante la partie claire et on met le précipité sur le fdtre. Après un premier lavage à l'alcool et à l'éther, le précipité est broyé dans un petit mortier avec un peu d'alcool; il <>st replacé ensuite sur le filtre et soumis à un second lavage à l'alcool et à l'éther, puis desséché dans le vide.

Par cette méthode on obtient un produit que Lintner nomme cliastase brute et que l'on peut encore purifier par (hssolution dans l'eau et précipitation par l'alcool. Cette puri- (ication conduit à un produit d'une composition constante, mais peu actif.

Cette méthode donne de bons résultats, à condition que les opérations soient pratiquées avec une certaine rapidité afin d'éviter que la diastase précipitée ne se trouve au conlact de l'air avant qu'elle ne soit complètement déshydratée. Toutefois, le produit obtenu est très riche en cendres ainsi

I2G LES ENZYMES

qu'en matières étrangères qui ont été précipitées de l'infusion de malt par l'alcool.

Pour aboutir à des produits plus purs et plus actifs nous conseillons d'employer un autre procédé.

Pour diminuer dans l'infusion de malt la quantité de substances extractives qui ne possèdent pas de pouvoir diastasique, on provoque une fermentation alcoolique de cette infusion avec des levures préalablement soumises à un régime très pauvre en azote. La fermentation alcoolique, provoquée par ces levures dans l'infusion de malt, détruit une grande partie des hydrates de carbone, élimine une quantité considérable de matières albuminoïdes et de sels, tout en laissant la diastase absolument intacte.

Voici comment on procède : on fait macérer loo grammes de malt réduit en poudre avec 3oo grammes d'eau à la température de 30° pendant i8 heures. On remue le mélange de demi-heure en demi-heure. Les drèches séparées par pression du liquide sont tamisées et lavées à l'eau; l'eau de lavage, jointe au liquide de la macération, est soumise à un filtrage. Le produit de la filtration est amené à ooo centimètres cubes, additionné de lo grammes de levure de bière et abandonné à la température de 28° pendant 48 heures. On filtre ensuite, et au liquide limpide on ajoute 700 centimètres cubes d'alcool. La levure qu'on emploie pour cette préparation doit avoir tout d'abord séjourné pendant 2/1. heures dans une solution de sucre à 10 pour 100. La fermentation fait perdre à la levure une partie de son azote et la rend très avide de matières albuminoïdes.

Avec 100 grammes de malt nous avons obtenu de 3 à 3,5 grammes d'une substance blanche ayant la même activité que 80 grammes du malt employé.

Une nouvelle méthode de préparation de la diastase a été proposée récemment j^ar V\ roblewsky qui prétend que la diastase préparée par les méthodes ordinaires se trouve toujours mélangée à un pentose, l'arabane. La méthode consiste

AMYLASE 127

en UI10 précipitalion IVacLionncc ])i-()voqu6c |)ar l'aclion des sels.

L'aulcur ajoute, goutte à goulle. à une solution d'aniylase, du sulfate d'ammonium jusqu'à ce qu'il se produise un trouble dans la solution. A ce moment le liquide conlient 5o pour 100 de sulfate d'ammonium; laissé en repos, pendant quelque temps, il se produit un précipité composé de petits flocons jaunâtres, précipité que l'on séj^are et qu'on lave avec une solution à 54 pour 100 de sulfate d'ammonium.

Ce précipité est très actif: ajouté à une solution d'amidon, il le transforme complètement et presque instantanément en sucre. D'après l'auteur ce dépôt serait uniquement composé de diastase.

Le liquide dont on a séparé le précipité est additionné à nouveau de sulfate d'ammonium jusqu'à la dose de 60 pour 100; il se produit alors un nouveau dépôt, qui, séparé, lavé et examiné, a été reconnu comme étant un mélange d'un pentose, l'arabane et de diastase.

Enfin, dans une troisième opération, on reprend le second liquide séparé de son précipité, on le sature par le sulfate d'ammonium et on recueille un nouveau produit uniquement composé de pentose. Il en résulte que quand on veut obtenir un produit très actif on doit prendre le premier précipité obtenu dans la solution contenant 5o pour 100 de sulfate d'ammonium.

L'amylase préparée de cette façon est très soluble dans l'eau. Elle ne se coagule pas par le chauffage, soit en solution neutre, soit après acidification par l'acide acétique ou l'acide clilorhydrique à faibles doses.

Une forte addition d'acide clilorhydrique produit cependant, par le chauffage, une coagulation sous forme de légers flocons. La solution d'amylase, additionnée d'une certaine dose d'acide nitrique, donne un léger précipité qui se redissout dans un excès de réactif. Elle fournit la réaction de Millon, celle du biuret et la réaction xantho-protéique. Sa solution addi-

tionnée de biclilorure de mercure laisse déposer un léger précipité. L'acide tannique ajoutée à la solution d'amylase produit un volumineux précipité soluble dans la soude étendue. Cette solution alcaline prend une légère coloration quand on l'abandonne à l'air à 5o'^ mais ne perd pas complètement son pouvoir liydratant.

L'amylase obtenue par A^roblewsky a donné à l'analyse une teneur en azote de i6,53 pour loo.

Propriétés de l'amylase. — L'amylase est douée de deux propriétés distinctes : elle liquéfie l'empois et elle transforme l'amidon ainsi que la dextrine en maltose.

Les deux propriétés de cette diastase peuvent facilement être mises en évidente par les expériences suivantes.

Dans lOO centimètres cubes d'eau maintenue à l'ébuUition, on ajoute lo grammes de fécule de pommes de terre diluée dans 20 centimètres cubes d'eau tiède. Le mélange forme un empois épais qui acquiert encore plus de consistance quand on le maintient pendant quelque temps au voisinage de 100°. On ajoute à cet empois quelques centimètres cubes d'une infusion de malt et on laisse le tout dans un bain-marie à la température de 7o"-75°. La masse pâteuse ne tarde pas à se fluidifier et dans un délai plus ou moins court, suivant la force diastasique de l'infusion, l'empois est transformé en un liquide transparent traversant le filtre en papier.

Ce liquide, d'un goût fade, contient des dextrines et seulement des traces de sucre. Il fournit avec la teinture d'iode une coloration bleue intense. On refroidit cette solution de dextrines et on ajoute de nouveau un peu d'infusion qu'on laisse agir à la température de Go^-ôo". Si l'on prélève de temps en temps des échantillons et qu'on les analyse on constate que la dextrine disparaît graduellement et qu'il apparaît dans le liquide un sucre réducteur: le maltose.

Les changements successifs qui s'opèrent dans le moût de dextrines, sous l'action de l'infusion de malt, peuvent

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■(Mro racilcmcnt suivis à l'aide de la loinlure d'iode. La coloration blcne foncée, obtenue dans la sohilion d'amidon par l'iode. s'alTailîlil gradnollemoni au fur et à nicsiire que la -saccharirication se poursuit. On obtient, au cours de la saccbarificalion, loule une série de nuances. Du bleu Ibncé que <l()nne l'amidon, on passe au violet, puis au rouge, puis au jaiuie. Enfin, lorsque la sacchaiificalion est fort avancée, l'iode ne donne plus de coloration.

L'action, à la fois saccbarifiante et liquéfiante de l'araylase a soulevé un doule sur rindi\idualité de cet enzyme.

On a émis riiypotlièsc que l'on se trouvait en présence de deux enzymes diflercnts, parce que les deux fonctions diastasiques de l'amylase se manifestent à des températures très différentes et que la saccbariQcation et la liquéfoction sont influencées très diversement par les conditions cliimicpies et physiques du milieu.

Toutefois, nous devons écarter, du moins jusqu'à ce qu'elle soit établie par des preuves certaines, cette interprétation qui apporte une nouvelle complication à l'étude de l'amylase.

Cette hypothèse ne serait acceptable que si l'on pouvait isoler complètement chacune des fonctions de l'amylase, c'est-à- <lire obtenir deux produits ayant l'un, uniquement le pouvoir liquéfiant l'autre, uniquement le pouvoir saccharifiant.

Cette séparation n'a jamais pu être faite, au contraire. En maintenant l'infusion de malt à 70° on favorise, il est ATai, surtout la liquéfliction, mais le produit obtenu contient aussi une faible quantité de sucre. Si, au contraire, on maintient la température de telle façon qu'elle favorise la saccharification, c'est-à-dire à ôo^-ôo". on produit, en même temps, une faible liquéfaction.

Influence des quantités. — L'étude de l'action de l'amylase conduit à des conclusions analogues à celles qu'a fournies l'étude du mode d'action de la sucrase. On constate Effront. Les Enzymes. 9

i3o LES E.\ZYMES

en effet si l'on suit la marche de la saccharifîcation que la quantité de sucre formé au début de l'hydratation est proportionnelle à la quantité de diastase employée. Dans la suite, quand le dédoublement de l'amidon est plus avancé, cetlc proportionnalité cesse d'exister.

La marche de la saccharification, lorsqu'on emploie, pour la même quantité d'amidon, des quantités croissantes d'amylase, est indiquée par le tableau suivant :